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Tristetraprolin (TTP) è una proteina della categoria delle RNA-binding proteins ed esplica la sua funzione legando sequenze ricche in adenina e uracile dette AU-rich sequences (AREs) situate nella regione 3’ terminale (3’UTR) di circa l’8% degli mRNA umani, inibendo così la loro espressione. TTP, insieme con altri membri di questa famiglia, svolge un ruolo fondamentale nel regolare l’espressione di geni pro-infiammatori e proliferativi (per esempio in seguito a stimoli flogistici o mitogenici) e una inibizione della sua funzione può essere concausa della trasformazione neoplastica. Questo coinvolgimento è stato osservato in svariati tipi di neoplasie fra le quali il cancro colo-rettale (CRC). Numerose evidenze, infatti, mostrano come una progressiva down-regolazione in vivo di questa proteina sia osservabile già dalle prime fasi tumorali del CRC; in questo contesto, infatti, il calo dell’espressione di TTP è concomitante al relativo aumento di alcuni suoi target, come VEGF e COX-2. Tuttavia il ruolo di questa ARE-binding protein nella progressione tumorale non è stato ancora del tutto chiarito. Il nostro obiettivo è quindi quello di identificare nuovi target di TTP e approfondire le nostre conoscenze riguardo al ruolo biologico di questa proteina nella fisiologia del colon e nella progressione del CRC. Grazie all’utilizzo di un database che raccoglie geni contenenti sequenze ARE, abbiamo selezionato tre putativi target di TTP noti per avere un ruolo nella progressione del cancro al colon: MACC1, ZEB1 e SOX9. Questi tre geni possiedono attività tumorigenica e sono correlati con la cosiddetta transizione epitelio-mesenchimale (EMT); la loro espressione, infatti, è un fattore prognostico negativo in quanto correla con l’insorgenza di metastasi in pazienti affetti da CRC.
Al fine di verificare se questi geni siano effettivamente target di TTP abbiamo over-espresso questa proteina in una linea cellulare di cancro del colon (HCT116) attraverso trasfezione liposomica e, come atteso, abbiamo osservato un calo dei livelli di trascritto dei putativi target. In seguito è stato svolto un saggio di transattivazione dove una porzione del 3’UTR di questi geni è stata inserita a valle del gene codificante per la luciferasi, ed è stato così possibile osservare un netto calo nell’attività della luciferasi nei campioni iper-esprimenti TTP rispetto ai campioni di controllo.
Infine ci siamo concentrati sui possibili effetti di TTP sul processo di EMT e sulla sua relazione con la via di segnalazione cellulare di WNT/β-catenina, via di fondamentale importanza nello sviluppo del CRC, la cui attività è direttamente correlata alla promozione del processo di EMT. E’ inoltre noto il coinvolgimento di questa via intracellulare nella regolazione di MACC1, ZEB1 e SOX9, anche se con differenti meccanismi e intensità. Abbiamo verificato come l’induzione di TTP porti all’aumento di espressione di E-caderina, un’importante proteina di adesione cellulare e uno dei principali marcatori epiteliali. Infine abbiamo dimostrato come l’inibizione della via di β-catenina, attraverso l’utilizzo di un inibitore farmacologico, si rifletta in un netto aumento di espressione del mRNA di TTP.
L’insieme di questi dati mostra come TTP potrebbe essere negativamente regolato dalla via di β-catenina attraverso meccanismi ancora da chiarire e che possa quindi giocare un ruolo nella regolazione del processo di EMT.

A central role in post-transcriptional regulation of gene expression is played by mRNA turnover that controls mRNA stability and translation allowing for rapid changes in messengers levels. Tristetraprolin (TTP) is a RNA-binding protein which acts by binding to AU-rich sequences (called ARE) in the 3’ untranslated region (3’-UTR) of about 8% of the human transcripts and thereby inhibiting their expression. TTP and the other members of this family exert a fundamental role in limiting the expression of pro-inflammatory and pro-proliferative genes (for example after a flogistic or mitogenic stimuli) and impairment in their function can indeed lead to neoplastic transformation, as observed in a variety of cancerous malignancies, including colorectal cancer. Many experimental evidences, in fact, show a progressive down-regulation of this protein (in vivo) starting in early stages of tumor development. In colon cancer (CRC) TTP down-regulation comes with a concomitant up-regulation of some of its targets genes like VEGF and COX-2 is observed but its role in the development of this disease is still to be fully elucidated. Our aim was to identify newly described targets of TTP and to deepen our knowledge of the biological the role of this protein in colon physiology and colorectal carcinogenesis. Taking advantage of a database of ARE-containing genes we selected three putative TTP targets having an overt role in colon tumorigenesis, namely MACC1, ZEB1 and SOX9. These genes show, with different extent, an oncogenic activity and a positive correlation with epithelial-to-mesenchimal transition (EMT). Their up-regulation allows cancer cells to initiate metastasis through the acquisition of mobility and invasiveness in CRC affected patient. Here is demonstrated that ZEB, SOX9 and MACC1 are TTP targets and that the restoration of TTP expression in colon cancer cell lines correlates with a down regulation of their mRNA. In order to validate these genes as new TTP targets we performed TTP over-expression by transfection in HCT116 human cancer cell line. We observed a significant decrease in ZEB, SOX9 and MACC1 mRNA levels. Subsequently we decided to perform luciferase assays inserting 3’UTR of a target gene in a specific vector together with luciferase gene. We performed this assay on engineered cells after TTP over-expression and compared them to the negative control. A decrease in luciferase activity has been observed, caused by the binding of TTP to the 3’UTR of target gene. Subsequently, we focused on possible TTP effects on EMT process through the interaction with Wnt/β-catenin pathway. Indeed, this pathway is crucial in CRC progression and a main regulator in EMT process. Moreover, β-catenin is thought to have a direct influence on ZEB, SOX9 and MACC1 through different mechanisms. Using HCT116 cell line we found that TTP induction increased the expression of protein E-Cadherin, a fundamental protein in adherent junctions and a main epithelial marker. Finally, β-catenin pathway inhibition using a pharmacological inhibitor brought to a marked increase of TTP mRNA. Altogether these data indicate that TTP could be negatively regulated by β-catenin pathway through still not elucidated mechanisms and then have a role in EMT regulation.