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• mielofibrosi
• overespressione

Le sindromi mieloproliferative Ph1-negative (MPN) sono disordini clonali che hanno origine da mutazioni a carico della cellula staminale emopoietica e che sono caratterizzate da un'eccessiva produzione di cellule del sangue, connessa ad un'ipersensibilità da citochine. Le MPN comprendono la Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Essenziale (TE) e la Mielofibrosi Primaria (PMF). Per l'identificazione dei meccanismi patogenetici delle MPN è stata fondamentale la scoperta della mutazione JAK2V617F, presente nel 90% dei casi di PV e in circa il 50-60% dei pazienti di TE e PMF; la mutazione JAK2V617F, così come altre mutazioni caratterizzate successivamente, non è sufficiente per spiegare completamente lo sviluppo, l'eterogeneità e la progressione delle MPN. In particolare, la PMF presenta un decorso caratterizzato da espansione della linea megacariocitaria, sviluppo di fibrosi midollare, osteosclerosi ed emopoiesi extramidollare. Al fine di caratterizzare ulteriormente le alterazioni molecolari alla base della patogenesi della PMF è stato analizzato su chip Affymetrix HG-U219 il profilo di espressione genica di campioni di progenitori emopoietici CD34+ di PMF, e confrontato con il profilo derivante da CD34+ di donatori normali. L'analisi ha permesso di individuare una lista di geni differenzialmente espressi coinvolti nei processi di fibrosi e di migrazione o implicati in tumori solidi o neoplasie ematologiche. Sulla base del livello di modulazione dell'espressione e del significato biologico, dai dati di array sono stati selezionati 63 geni per la successiva validazione mediante qRT-PCR. All'interno della lista di geni upregolati nei campioni di PMF e validati in qRT-PCR, è stato selezionate il fattore di trascrizione c-Maf, già riportato come overespresso nel mieloma multiplo. Esistono due varianti del trascritto di c-Maf (RefSeq NM_005360 e NM_001031804), che a livello proteico condividono tutti i domini funzionali del fattorte trascrizionale, inclusi quelli di legame al DNA e di transattivazione. Per studiare il ruolo di c-Maf nell'emopoiesi, le due varianti sono state overespresse mediante trasduzione retrovirale dei progenitori emopoietici CD34+. Gli effetti dell'overespressione di c-Maf sul ciclo cellulare sono stati monitorati mediante analisi con propidio ioduro, mentre gli effetti sul differenziamento sono stati valutati in coltura liquida, mediante analisi morfologica e immunofenotipica, e in terreno semisolido. In particolare, è stata messa a punto una condizione di trasduzione in coltura seerum-free al fine di valutare il differenziamento megacariocitario, altrimenti inibito dal siero umano o bovino. Inoltre tramite analisi microarray è stato valutato il profilo di espressione delle cellule overesprimenti c-Maf rispetto al campione trasdotto con il vettore vuoto. Infine, è stato valutato l'effetto su proliferazione e differenziamento indotto dal silenziamento di c-Maf nei progenitori emopoietici CD34+ mediante nucleofezione di small interference RNAs (siRNAs). I dati ottenuti inseguito all'overespressione ed al silenziamento di c-Maf hanno mostrato che in cellule CD34+ normali c-Maf determina un accumulo delle cellule in fase G0-G1 e promuove il differenziamento megacariocitario a scapito di quello eritroide. Questi risultati sono stati confermati dall'analisi microarray, che ha evidenziato l'upregolazione di geni coinvolti nel differenziamento megacariocitario e la downregolazione di geni coinvolti nel differenziamento eritroide. Inoltre, tra i geni upregolati in seguito ad overespressione di c-Maf sono presenti i geni coinvolti nei processi di fibrosi e di migrazione, che sono deregolati nella PMF. Questi dati complessivamente supportano l'ipotesi del coinvolgimento di c-Maf nella patogenesi della PMF, non solo nell'espansione della linea megacariocitaria, ma anche nello sviluppo della fibrosi midollare e nella mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche dal microambiente midollare.

Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal disorders that arise from the oncogenic transformation of the hematopoietic stem cell and are characterized by an abnormal production of blood cells, related to a growth factors hypersensitivity or independence. MPNs include Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocytosis (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). The most important milestone in understanding the MPN pathogenetic mechanisms was the identification of JAK2V617F mutation, occurring in about 90% PV patients and about 50-60% ET and PMF patients; nevertheless, JAK2V617F mutation, like the additional mutations subsequently described, is not completely sufficient to explain MPN development, heterogeneity and progression. Particularly, PMF is characterized by a progressive expansion of the megakaryocytic lineage, myelofibrosis development, osteosclerosis and extramedullary haematopoiesis. In order to further characterize the molecular mechanisms underlying the PMF pathogenesis, we compared the gene expression profile of PMF patients and healthy donors CD34+ hematopoietic progenitors cells by Affymetrix HG-U219. Microarrays data allowed the identification of differentially expressed genes involved in fibrosis and migration or deregulated in solid tumors and hematological neoplasms. A set of 63 genes from microarrays data was selected for qRT-PCR validation, based on the modulation of the expression levels in PMF versus normal samples and on the biological role. The transcription factor c-Maf was selected among the validated genes for further experiments as up-regulated in PMF samples and already reported to be overexpressed in multiple myeloma. There are two different variants of c-maf trascript (RefSeq NM_005360 e NM_001031804) , whose encoded proteins share all the functional domains of the transcription factor, included transactivation and DNA binding domains. In order to study the role of c-Maf in haematopoiesis, the two variants were overexpressed in CD34+ hematopoietic progenitor cells by retroviral transduction. c-Maf overexpression effects on cell cycle were monitored through Propidium Iodide analysis, while effects on differentiation were assessed by morfological and immunophenotypic analysis in liquid culture as well as in semisolid medium. Particularly, we set a serum-free transduction culture condition in order to promote megakaryocyte differentiation, otherwise inhibited by human or bovine serum. Besides, we performed gene expression profiling of c-Maf-overexpressing normal CD34+ hematopoietic progenitor cells compared to the control sample, transduced with the empty vector. Finally,we evaluated c-Maf silencing effects on proliferation and differentiation of normal CD34+ hematopoietic progenitor cells by small interference RNAs (siRNAs) nucleofection. Functional data from c-Maf overexpression and silencing experiments showed that c-Maf causes a G0-G1 phase cell cycle arrest and promotes megakaryocyte differentiation at the expense of erythroid differentiation in normal CD34+ cells. These results were confirmed from microarray analysis, which highlighted the upregulation of genes involved in megakaryocyte differentiation together with the downregulation of erythroid genes. Worth of note, among the genes upregulated upon c-Maf overexpression, we found several genes involved in fibrosis and migration, which are strongly deregulated processes in PMF. Overall, these data support a possibile contribution of c-Maf to PMF pathogenesis, particularly to the expansion of the megakaryocyte lineage as well as to the bone marrow fibrosis progression and the hematopoietic stem cell mobilization from the bone marrow microenvironment.