Riassunto analitico
I lieviti hanno un ruolo chiave in numerosi bioprocessi industriali, dalla produzione di alimenti fermentati alla sintesi di proteine ricombinanti e metaboliti. In campo alimentare, la progettazione di nuovi starter enologici si basa su tecniche non-OGM che sfruttano e amplificano la diversità genetica e fenotipica di starter pre-esistenti appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae. Fra queste, l’ibridizzazione sessuale rappresenta un approccio efficace per generare variabilità poiché sfrutta il ciclo vitale e la ricombinazione meiotica dei lieviti. Scopo della Tesi di Ricerca è stato l’ottenimento di nuovi ceppi di lievito di interesse enologico con migliorate caratteristiche fermentative tramite l’ibridizzazione diretta di spore di S. cerevisiae. In particolare è stato considerato 20 ceppi parentali, di cui 11 commercializzati come starter enologici e 9 ottenuti per evoluzione adattativa da ceppi wild-type e con incrementata produzione di glutatione. Uno screening preliminare ha selezionato un subset di 11 ceppi sulla base dell’efficienza di sporificazione e della viabilità delle spore da sottoporre al mating spore-to-spore. Secondariamente è stata effettuata la caratterizzazione di geni contenenti regioni microsatellitari nei ceppi parentali per individuare markers molecolari idonei a confermare l’ibridizzazione. I markers discriminanti sono state le regioni microsatellitari nei geni HSP150, DAN4 e PIR3, per le quali è stato messo a punto un protocollo di colony PCR che ha consentito di effettuare, in modo rapido e riproducibile, la validazione di numerosi ibridi putativi ottenuti per mating spore-to-spore. Sono state effettuate 6 serie di incroci. Su 83 tentativi di ibridizzazione sono stati ottenuti e validati 6 ibridi: Mo21T2-10 X PB2590-1, Iper-R X PB2033-1, Iper-R X PB2033-2, Iper-R X PB2033-8, Iper-R X V1F1-B-6 e Iper-R X V1F1-B-7. Gli ibridi e i rispettivi parentali sono stati sottoposti a screening per valutarne le differenze in performance fermentativa, potere alcoligeno, produzione di composti del metabolismo dello zolfo e profilo dei composti minoritari della fermentazione alcolica. A questo scopo sono state allestite prove di micro-vinificazione su mosto pastorizzato. A fine fermentazione i vini sono stati caratterizzati per profilo acidico, contenuto in zuccheri residui, glicerolo, etanolo, glutatione e SO2. L’ibrido Iper-R X PB2033-8 ha mostrato il più alto vigore fermentativo, distinguendosi sia dai ceppi parentali, sia dagli altri 5 ibridi, mentre la produzione di composti secondari è risultata intermedia rispetto ai parentali. Iper-R X PB2033-8 ha mostrato un potere alcoligeno paragonabile ai ceppi commerciali più alcol-tolleranti, dimostrandosi leggermente inferiore solo a PB2033. L’analisi dei Componenti Princiali (PCA) su un set di 13 descrittori ha mostrato come gli ibridi segregassero in modo variabile dalle coppie di parentali sia rispetto a PC1 (riconducibile all’efficienza fermentativa) che PC2 (riconducibile al metabolismo secondari). I 3 ibridi “fratelli” (derivanti da spore diverse degli stessi genitori Iper-R e PB2033) hanno mostrato perfomance fermentative e profilo dei metaboliti secondari altamente diversificate. Questo dato è coerente alla tecnica di ibridizzazione diretta, che è volta a massimizzare la variabilità dei ceppi ibridi, evitando la costituzione di linee parentali omozigoti. La variabilità fenotipica degli ibridi è riconducibile all’alto grado di eterozigosità dei ceppi parentali, che producono gameti geneticamente diversi l’uno rispetto all’altro, i quali, in seguito mating, danno origine a linee ibride divergenti. In conclusione la presente tesi ha prodotto: un metodo rapido di screening e validazione di ibridi intraspecifici S. cerevisiae x S. cerevisiae; un candidato ibrido da proporre come nuovo starter della fermentazione alcolica per l’industria enologica.
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