Riassunto analitico
L’ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) regolano importanti eventi fisiologici a livello ovarico mediante il legame al loro recettore di membrana (LHCGR). In particolare, LH, insieme all’ormone follicolo stimolante (FSH) e agli estrogeni, svolge un ruolo centrale nella fase di crescita, selezione del follicolo ovarico e ovulazione. Precedenti studi hanno dimostrato che il recettore dell’FSH (FSHR) è in grado di formare eteromeri sulla superficie delle cellule della granulosa con il recettore degli estrogeni accoppiato a proteina G (GPER). Tali strutture regolano i processi proliferativi ed apoptotici della gametogenesi.
Il progetto ha come obiettivo l’indagine della formazione di eteromeri tra LHCGR e GPER, e di come questi influenzino la fisiologia ovarica.
Per questo studio sono state utilizzate cellule Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) nelle quali LHCGR e GPER sono stati espressi in seguito a co-trasfezione, e cellule primarie della granulosa umane (hGLC) esprimenti naturalmente entrambi i recettori. La presenza di complessi eteromerici LHCGR/GPER è stata dimostrata in cellule HEK293 mediante bioluminescence resonance energy trasnfer (BRET), utilizzando come controllo negativo cellule HEK293 co-trasfettate con LHCGR e una forma mutata di GPER (GPER-mut), incapace di interagire con altri recettori. I dati sono stati confermati in cellule hGLC mediante proximity ligation assay (PLA). In seguito si è valutato come gli eteromeri possano influenzare e modulare l‘attivazione della via di trasduzione intracellulare associata a LHCGR, in cellule HEK293 co-esprimenti LHCGR e GPER, e in hGLC nelle quali l’espressione di GPER è stata inibita mediante siRNA. L’accumulo intracellulare di cAMP in seguito a stimolazione con dosi costanti di LH, hCG ed estradiolo (E2) è stato valutato mediante metodica BRET, in HEK293, e homogenous time resolved fluorescence (HTRF) in hGLC. È stato inoltre studiato in cellule HEK293 il rilascio intracellulare di calcio mediante BRET e l’accumulo intracellulare della molecola inositol-monofosfato (IP1), mediante HTRF, in seguito a stimolazione con LH, hCG ed E2. Infine, in hGLC trattate o meno con siRNA contro GPER e con LH, hCG ed E2 è stata valutata mediante western blotting la fosforilazione di ERK 1/2, CREB e p38-MAPK, le quali regolano i processi di steroidogenesi, sopravvivenza cellulare e apoptosi, e la produzione di progesterone mediante immunoassay.
I risultati degli esperimenti BRET confermano la presenza di eteromeri LHCGR/GPER, dato sostenuto anche dalle immagini ottenute in cellule hGLC mediante PLA. La co-espressione recettoriale non influenza l’attivazione della cAMP/PKA-pathway come dimostrato dalla produzione di cAMP, la fosforilazione di ERK 1/2, CREB e p38-MAPK e la produzione di progesterone, indotti dal trattamento con LH, hCG e E2. Infatti, il trattamento non induce significative differenze nell’attivazione di tali vie di trasduzione del segnale tra cellule che esprimono entrambi i recettori e esprimenti solo LHCGR. Al contrario, dati promettenti sono emersi dai risultati ottenuti dalla valutazione del rilascio di calcio e dell’accumulo IP1 intracellulari, eventi che vengono inibiti in cellule HEK293 co-esprimenti LHCGR e GPER rispetto a cellule esprimenti il solo LHCGR.
In conclusione, i risultati ottenuti dimostrano un possibile coinvolgimento del complesso LHCGR/GPER nella regolazione di aspetti endocrini a livello ovarico.
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