Riassunto analitico
L’ormone luteinizzante (LH), prodotto dall'ipofisi, e la gonadotropina corionica umana (hCG), secreta dalla placenta e dal trofoblasto, sono ormoni glicoproteici indispensabili per lo sviluppo e la riproduzione. LH e hCG esercitano la loro funzione mediante l'interazione con LHCGR, situato sulla membrana plasmatica delle cellule della granulosa e della teca, nell'ovaio. LHCGR appartiene alla famiglia dei recettori accoppiati a proteina G (GPCR). Il legame tra LH/hCG con LHCGR determina un cambiamento conformazionale del recettore, il quale induce l’attivazione contemporanea di diverse vie di trasduzione del segnale intracellulare che mediano eventi proliferativi, steroidogenici e pro/anti-apoptotici, grazie all’accoppiamento a diverse proteine G. Tra questi, avviene la scissione della subunità alfa-s della proteina G dal dimero beta-gamma, attivando l’enzima adenilato ciclasi, il quale converte l’ATP in cAMP e pirofosfato. L’aumento della concentrazione del cAMP attiva la protein kinase A (PKA), che a sua volta induce la fosforilazione di extracellular-regulated kinase (ERK1/2) e di cAMP-responsive element binding-protein (CREB), che mediano la trascrizione di geni coinvolti nella proliferazione cellulare e nella steroidogenesi.
È stata ottenuta una linea cellulare della granulosa umana (KGN) esprimente stabilmente LHCGR, sotto il controllo di un promotore inducibile. Lo scopo di tale studio è caratterizzare la via di trasduzione del segnale mediata da tale recettore in cloni stabili. La funzionalità del recettore è stata valutata misurando l’accumulo di cAMP intracellulare e la produzione di progesterone mediante homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF). Inoltre, l’espressione inducibile e l’integrazione del recettore è stata dimostrata valutando la fosforilazione di CREB e ERK1/2 in assenza e in presenza di LH e hCG e dell’inibitore di MEK (U0126), di PKA (H89) e della fosfolipasi C (U73122) mediante Western blotting.
I dati ottenuti dimostrano che in tale clone, indotto con doxyciclina per 24 h e stimolato per 20 minuti con hCG, non si assiste ad accumulo di cAMP intracellulare, nonostante venga attivata la produzione dello steroide progesterone. Dagli esperimenti eseguiti mediante Western blotting è stato dimostrato che, in presenza degli inibitori di MEK, PKA e fosfolipasi C, non si ha attivazione di pCREB. Invece, il trattamento delle cellule con l’inibitore di PKA, induce la fosforilazione di ERK1/2, anche se in maniera minore rispetto agli altri inibitori.
In conclusione, si può evincere come la sintesi di progesterone, nota per essere dipendente da cAMP/PKA-pathway, sia disaccoppiata questa via di trasduzione del segnale nel clone KGN analizzato.
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