Riassunto analitico
MafB è un fattore trascrizionale appartenente alla famiglia delle Grandi Proteine Maf e varie evidenze sperimentali, ottenute nel nostro laboratorio, hanno dimostrato il suo ruolo come master gene del differenziamento monocito-macrofagico umano. Tuttavia, alcuni aspetti sulla funzione biologica e sul meccanismo d’azione di questo fattore di trascrizione non sono stati attualmente chiariti. In particolare, non sono stati identificati i geni di risposta primaria di MafB nel contesto monocito-macrofagico ed, inoltre, non è stato chiarito il suo ruolo nella polarizzazione macrofagica. Su questi due elementi è stato principalmente focalizzato il lavoro sperimentale presentato in questa tesi.
Al fine di identificare i geni regolati trascrizionalmente da MafB nella monocitopoiesi, sono stati allestiti esperimenti preliminari nella linea cellulare THP1 trattata con esteri del forbolo (PMA), un agente in grado di indurre il differenziamento macrofagico determinando, contemporaneamente, una marcata up-regolazione di MafB. In questo modello di differenziamento in vitro ed in altri contesti cellulari monocito-relati acquisiti in laboratorio, è stata osservata la ricorrente co-espressione di MafB con i geni codificanti per il recettore dell’ IL-7 (IL-7R) e per la Metallo-Proteinasi 9 (MMP9). Inoltre, è stato ulteriormente osservato che il silenziamento genico di MafB, ottenuto nello stesso modello biologico, è in grado di determinare la down-regolazione di IL-7R e di MMP9, suggerendo questi due geni come putativi target del fattore di trascrizione in esame. Al fine di dimostrare questa ipotesi, successivi esperimenti di Gel Shift, Immuno-precipitazione della Cromatina (ChIP) e saggi di trans-attivazione della Luciferasi, hanno consentito di dimostrare che MafB è in grado di legare le sequenze enhancer MARE (MafB responsive elements) localizzate all’interno delle regioni promotrici dei due geni studiati e di promuovere la loro trans-attivazione. I risultati ottenuti hanno quindi permesso di concludere che IL-7R e MMP9 sono geni di risposta primaria di MafB.
Successivamente, l’attività di ricerca è stata rivolta a chiarire il ruolo di MafB e dei suoi downstream target genes nella polarizzazione macrofagica, ovvero in una fase di specializzazione funzionale dei monociti/macrofagi che segue il processo di differenziamento. Attualmente sono state individuate tre diverse modalità di polarizzazione: l’attivazione classica, l’attivazione alternativa e la de-attivazione, principalmente mediate da LPS/IFNγ, IL-4 e IL-10, rispettivamente. Questi fenotipi rappresentano i diversi stati funzionali dei monociti/macrofagi durante il processo della flogosi e nel corso della successiva risoluzione del danno tissutale da essa indotto. Esperimenti di stimolazione condotti in vitro su monociti umani utilizzando gli stimoli sopra citati, hanno consentito di dimostrare che il trattamento con IL-10 è in grado di aumentare, in modo specifico, i livelli di espressione di MafB, suggerendo quindi un ruolo svolto da questo fattore nella pathway di de-attivazione macrofagica. Dati presenti nella letteratura scientifica indicano che IL-10, al fine di esplicare la sua attività biologica, si lega specificamente al suo recettore di membrana, ed attiva principalmente la pathway JAK1-STAT3. Sulla base di ciò abbiamo ipotizzato che il fattore di trascrizione in esame potesse essere un gene bersaglio di STAT3 e, mediante esperimenti di ChIP e di trans-attivazione, abbiamo osservato che la regione promotrice di MafB possiede un sito enhancer, biologicamente attivo, per STAT3. In conclusione, sulla base dei risultati descritti, siamo in grado di dimostrare l’esistenza di una precisa pathway regolatoria in cui, in presenza di IL-10, STAT3 è in grado di up-regolare MafB che, a sua volta, determina un incremento dei livelli di espressione dei geni bersaglio IL-7R ed MMP9, coinvolti nei processi di riparo e mantenimento dell’integrità tissutale.
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