Riassunto analitico
Il sale rappresenta uno dei principali stress abiotici che influenzano la crescita e la sopravvivenza dei microrganismi nei bioprocessi alimentari e industriali. Per contrastare la bassa attività dell’acqua dovuta a elevate concentrazioni di sale, le cellule microbiche producono osmoliti compatibili, come i polioli, e regolano l'espressione di geni codificanti per proteine antiporto Na+/H+. Il complesso Zygosaccharomyces rouxii comprende lieviti alo-tolleranti importanti per le alterazioni e le fermentazioni degli alimenti, che costituiscono un modello interessante per studiare la risposta microbica a tale stress. Il complesso include la specie aploide Z. rouxii, la specie diploide Z. sapae e un gruppo di ceppi allodiploidi con posizione tassonomica incerta. Oltre che nelle dimensioni del genoma e nella ploidia, questi lieviti mostrano una marcata variabilità nella risposta iperosmotica, con una tolleranza decrescente al sale fra ceppi allodiploidi, Z. sapae e Z. rouxii. Per chiarire le basi fisiologiche e trascrizionali di tale variabilità, nel presente lavoro è stato valutato come Z. sapae ABT301 (mediamente alo-tollerante) e il ceppo allodiploide ATCC42981 (altamente alo-tollerante) differiscono in risposta al sale nella produzione di polioli e nella regolazione trascrizionale dei geni SOD codificanti per proteine antiporto Na+/H+ sodio-specifiche.
La produzione intra- ed extra-cellulare di polioli è stata valutata in fase esponenziale e stazionaria. In presenza di NaCl 2M, ATCC42981 accumula intracellularmente una quantità di glicerolo da 3 a 5 volte più alta rispetto alla condizione standard in cui il ceppo estrude glicerolo. Al contrario, la presenza di Na+ non influenza la concentrazione intracellulare di glicerolo in ABT301. Rispetto ad ABT301, ATCC42981 cresciuto in condizioni standard, mostra una maggiore produzione extra-cellulare di glicerolo sia in fase esponenziale che stazionaria. Sotto stress salino, ATCC42981 produce e accumula più glicerolo di ABT301. A differenza di altri lieviti sale-tolleranti, sotto stress salino, ATCC42981 e ABT301 non aumentano la produzione di mannitolo e arabitolo, suggerendo che la loro produzione non è attivata da alte concentrazioni saline. Per quanto riguarda l’antiporto Na+/H+, l’analisi in GenBank mostra come ABT301 e ATCC42981 differiscono per il pattern dei geni SOD, con ABT301 che presenta le varianti SOD2-22 e SOD22, e ATCC42981 quelle SOD2 e SOD22. Per studiare l’espressione dei geni SOD, sono state preliminarmente settate le condizioni di crescita e il metodo di estrazione dell’RNA più idonei per le successive analisi RT-PCR e RT-qPCR. RT-PCR effettuata con set di primer SOD2-22/SOD2 e SOD22-specifici mostra come entrambi i geni SOD2-22 e SOD22 di ABT301 sono espressi in condizioni standard e in sale in entrambe le fasi cellulari. Allo stesso modo, ATCC 42981 in fase esponenziale con e senza sale trascrive entrambi i geni SOD2 e SOD22. Questo è in contrasto con un precedente lavoro che ha mostrato come in condizioni iperosmotiche solo il gene ATCC 42981 SOD2 è trascritto. In fase stazionaria, il gene SOD22 non è trascritto in cellule di ATCC 42981 cresciute in condizioni standard e in presenza di sale, mentre solo il gene SOD2 rimane attivamente trascritto. Questo suggerisce che la trascrizione dei geni SOD2/SOD22 è più legata alla fase di crescita che allo stress salino. Per confermare quantitativamente i dati ottenuti in RT-PCR, sono stati messi a punto due test SYBRgreen qPCR, disegnando primer SOD2-22/SOD2- e SOD22-specifici e utilizzando il gene ACT come riferimento. L’analisi qPCR evidenzia che in fase esponenziale sia ABT301 che ATCC42981 non cambiano l’espressione dei geni SOD2-22/SOD2 e SOD22 in risposta la sale, mentre solo ATCC42981 reprime il gene SOD22 in fase stazionaria. Il presente lavoro costituisce il primo tentativo di discernere i meccanismi coinvolti nell’alotolleranza in Z. sapae e in ceppi allodiploidi.
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Abstract
Salt represents one of the major abiotic stresses affecting microbial growth and survival in food and industrial bioprocessing. To counteract low water activity determined by high salt concentration, microbial cells produce polyols as compatible osmolytes, and transcriptionally regulate genes encoding Na+/H+ antiporter proteins.Zygosaccharomyces rouxii complex is a challenging model to study microbial response to high salt concentration, as it consists of highly salt-tolerant yeasts relevant for food spoilage and fermentation.In particular, it comprises the haploid species Z. rouxii, the diploid species Z. sapae, and a subgroup of allodiploid strains with uncertain taxonomical position. In addition to a marked variation in ploidy and genome size, these yeasts exhibit near-continuity of hyperosmotic stress response, with allodiploid strains being more halo-tolerant than Z. rouxii and Z. sapae. To unravel physiological and transcriptional bases of this phenotypic variation, in this work we compared Z. sapae ABT301 (middle salt-tolerance) and allodiploid strain ATCC42981 (high salt-tolerance) for polyol production and transcriptional regulation of Na+/H+ antiporter-encoding SOD genes in response to 2M NaCl. Intra- and extra-cellular productions of glycerol, mannitol and arabitol were evaluated at exponential and stationary phases under standard and salt-stress conditions. Salt-stressed ATCC42981 cells accumulate 3- to 5-fold-higher glycerol amounts than unstressed cells. In contrast, salt-stressed ABT301 cells do not significantly increase intra-cellular glycerol compared to not-stressed cells. In standard conditions, ATCC42981 produces higher extracellular glycerol amount than ABT301 both at exponential and stationary phases.Under osmotic stress, ATCC42981 produces and intracellularly accumulates more glycerol than ABT301, mainly at the exponential phase.Differently from other halo-tolerant yeasts, under salt stress neither ATCC42981 nor ABT301 increases mannitol and arabitol concentrations at any growth phase, therefore suggesting that mannitol and arabitol production is not triggered by salt. Concerning Na+/H+ antiporter, GenBank database analysis shows that ABT301 and ATCC42981 differ for the pattern of SOD genes. ABT301 has SOD2-22 and SOD22 variants, whereas ATCC42981 has SOD2 and SOD22 variants. To study SOD gene expression, the most suitable growth conditions and RNA extraction method are preliminary set up for subsequent RT-PCR and RT-qPCR analyses. Since nutrient limitation rather than the presence of salt was responsible for the inability of yeasts to grow under hypersaline stress, a nitrogen-rich medium was chosen to selectively study the effect of salt on osmostress response. RT-PCR carried out with SOD2-22/SOD2 and SOD22-specific primer sets showed that both SOD2-22/SOD2 and SOD22 genes are transcribed by unstressed and salt-stressed ABT301 and ATCC42981 cells at exponential and stationary-phases.This is in contrast to a previous work which showed how only SOD2 gene is transcribed in salt-stressed ATCC42981 cells. For SOD gene transcriptional regulation, two SYBR green qPCR assays were designed with SOD2-22/SOD2- and SOD22-specific primers by using actin encoding ACT1 gene as reference. qPCR analyses showed that neither ABT301 nor ATCC42981 cells significantly change SOD2-22/SOD2 and SOD22 genes in response to salt. These evidences suggests that, under the nitrogen-rich and salt-stressed conditions tested in this study, transcriptional regulation of both SOD2-22/SOD2 and SOD22 genes is salt-independent.The work described in this thesis represents the first attempt to discern physiological and transcriptional mechanisms underlying the response to hyperosmotic stress in Z. sapae and allodiploid Zygosaccharomyces yeasts.
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