Riassunto analitico
L'emocianina è una proteina respiratoria di colore blu, presente nell'emolinfa di molti artropodi e molluschi, che svolge un ruolo essenziale nel trasporto di ossigeno. Tra i principali trasportatori di ossigeno negli organismi viventi troviamo l’emoglobina, l'emocianina e l’emeritrina. A differenza dell'emoglobina e dell’emeritrina, che legano l'ossigeno tramite il ferro, l'emocianina utilizza il rame, garantendo l'apporto di ossigeno in questi invertebrati.
Questo progetto di tesi, svolto presso il laboratorio di Chimica Bio-inorganica dell'Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) e coordinato dal Professor Palacios Bonilla Oscar, ha riguardato l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione dell’emocianina.
Il protocollo di estrazione dell’emolinfa dalle chiocciole Cornu aspersum è stato ottimizzato per isolare selettivamente la proteina target, eliminando le impurità mediante tecniche di precipitazione. L’emocianina purificata è stata poi analizzata con diverse tecniche per studiarne le proprietà strutturali e funzionali.
La spettroscopia UV-Vis è stata impiegata per monitorare gli stati di ossigenazione della proteina, sfruttando i suoi caratteristici picchi di assorbimento a 280 nm e 350 nm.
La spettroscopia a emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES) ha consentito di quantificare gli elementi costituenti l'emocianina, monitorando l'efficacia del processo di purificazione e dimostrando la rimozione graduale delle impurità. Inoltre, questa tecnica ha consentito di determinare la concentrazione della proteina e il contenuto percentuale di rame.
La Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM) ha permesso di visualizzare la struttura quaternaria dell'emocianina, rivelandone lo stato di aggregazione e la morfologia complessiva.
La cromatografia a esclusione dimensionale ad alte prestazioni (SEC-HPLC) ha confermato lo stato di aggregazione previsto della proteina e l'omogeneità del campione purificato.
In conclusione, le modifiche apportate al protocollo hanno ottimizzato tempi e risorse, migliorando l’efficienza operativa e promuovendo una ricerca più sostenibile.
Le tecniche analitiche utilizzate hanno permesso una caratterizzazione e quantificazione accurata dell'emocianina, aprendo la strada a futuri studi volti a comprendere meglio le sue funzioni biologiche e a esplorare potenziali applicazioni cliniche e pratiche.
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Abstract
Hemocyanin is a blue respiratory protein found in the hemolymph of many arthropods and mollusks, playing an essential role in oxygen transport. Among the main oxygen transporters in living organisms are hemoglobin, hemocyanin, and erythrin. Unlike hemoglobin and erythrin, which bind oxygen through iron, hemocyanin uses copper, ensuring oxygen supply in these invertebrates.
This thesis project, conducted at the Bio-inorganic Chemistry Laboratory of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) and supervised by Professor Palacios Bonilla Oscar, focused on the isolation, characterization, and quantification of hemocyanin.
The protocol for extracting hemolymph from Cornu aspersum snails was optimized to selectively isolate the target protein by eliminating impurities through precipitation techniques. The purified hemocyanin was then analyzed using various techniques to study its structural and functional properties.
UV-Vis spectroscopy was employed to monitor the oxygenation states of the protein, using its characteristic absorption peaks at 280 nm and 350 nm.
Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES) was used to quantify the elements that make up hemocyanin, assess the efficiency of the purification process, and demonstrate the gradual removal of impurities. This technique also allowed for determining the protein concentration and copper content.
Transmission Electron Microscopy (TEM) enabled visualization of the quaternary structure of hemocyanin, revealing its aggregation state and overall morphology. High-performance size-exclusion chromatography (SEC-HPLC) confirmed the expected aggregation state of the protein and the homogeneity of the purified sample.
In conclusion, the modifications made to the protocol optimized time and resources, improving operational efficiency and promoting more sustainable research. The analytical techniques used enabled accurate characterization and quantification of hemocyanin, paving the way for future studies aimed at better understanding its biological functions and exploring potential clinical and practical applications.
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