Riassunto analitico
L'ormone follicolo-stimolante (FSH) è una glicoproteina che svolge un ruolo centrale nella riproduzione e nello sviluppo. Recenti studi hanno dimostrato che i segnali proliferativi necessari per la regolazione della follicologenesi sono supportati da un recettore degli estrogeni accoppiato a proteine G (GPER) che si trova nei tessuti ovarici durante tutta la fase follicolare. È stato dimostrato che GPER forma eteromeri con FSHR sia sulla superficie delle cellule della granulosa umana che nella linea cellulare HEK293. I complessi FSHR-GPER modulano una rete di segnali proliferativi coinvolti nella regolazione della gametogenesi. Lo scopo dello studio è quello di chiarire meglio come i complessi FSHR-GPER possano influenzare l'internalizzazione di FSHR e modulare il signaling del recettore. Le cellule HEK293 sono state trasfettate in transiente con plasmidi codificanti i recettori, i biosensori per cAMP e marcatori specifici dell'endosoma. Quindi, la loro interazione è stata analizzata mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET). La cinetica di interazione tra FSHR e i markers endosomiali Rab 5, 7 e 11, in presenza o assenza di GPER, è stata misurata per 20 min in presenza e assenza di FSH. I dati ottenuti dagli esperimenti sono stati confermati mediante proximity ligation assay (PLA). Tale metodo consente la rilevazione in situ delle interazioni proteiche mediante microscopia a fluorescenza, fornendo la co-localizzazione intracellulare delle proteine studiate. L’analisi dell’attivazione del cAMP, mediante trattamento con FSH di cellule esprimenti FSHR, ha rivelato che il GPER inibisce la produzione del secondo messaggero. Tale effetto è sovvertito dall’inibizione dell’internalizzazione mediante reagente “Dynasore”. Il trafficking endosomiale precoce di FSHR, il cui marker è Rab5, è stato misurato in cellule HEK293 co-trasfettate con FSHR-Rluc e Rab5-Venus in assenza o presenza di GPER. Nelle cellule che esprimono solo FSHR, l'internalizzazione del recettore negli endosomi precoci avviene già a livello basale e aumenta nel tempo. La stessa tendenza si osserva quando le cellule sono trattate con FSH, suggerendo che il trafficking attraverso questa via non è favorito dal legame del ligando-recettore. Un risultato diverso è stato ottenuto nelle cellule che co-esprimono FSHR e GPER, poiché è stato rilevato un segnale ridotto sia alle condizioni basali che sotto trattamento con FSH. In questo caso, le cellule che co-esprimono FSHR e Rab7 hanno mostrato una maggiore interazione tra le due proteine e, quindi, la preferenziale internalizzazione FSH-indotta di FSHR attraverso endosomi tardivi. Tuttavia, la presenza di GPER riduce l'interazione FSHR-Rab7 suggerendo un blocco del trafficking di FSHR negli endosomi tardivi. L'analisi dell'interazione tra FSHR e il marker di recycling Rab11 dimostra che il trattamento con FSH riduce il livello di interazione basale tra le due molecole. Tale livello è ridotto dalla presenza di GPER. Gli esperimenti di PLA confermano quanto osservato in BRET, rivelando che la presenza di GPER sia responsabile della formazione di eteromeri con FSHR, i quali vengono accumulati a livello intracellulare anziché in membrana. I dati ottenuti in questo progetto dimostrano il coinvolgimento di GPER nella modulazione dell'internalizzazione di FSHR. GPER blocca il trafficking di FSHR sia attraverso endosomi precoci che tardivi. Questa evidenza suggerisce un accumulo a livello citoplasmatico dei complessi FSHR/GPER, spiegando la ridotta presenza di FSHR sulla superficie cellulare. In conclusione, questi dati possono avere implicazioni nella comprensione di alcuni eventi fisiopatologici a livello ovarico che coinvolgono il recycling di FSHR.
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