Riassunto analitico
Durante una risposta immunitaria, i linfociti T possono essere attivati dall’antigene per cui sono specifici (attivazione antigene-specifica) o da stimoli indipendenti dall'antigene, come alcune citochine prodotte in condizioni di infiammazione (attivazione bystander). Dal momento che, solo la prima delle due modalità di attivazione dipende dalla specificità dei singoli cloni di cellule T, ne consegue che riuscire a distinguere i linfociti T attivati dai due differenti tipi di stimolo è fondamentale per dissezionare la risposta immunitaria nei confronti di uno specifico antigene. In letteratura sono stati descritti diversi marcatori indotti da attivazione (AIMs), ma la loro caratterizzazione è principalmente qualitativa e non quantitativa. Inoltre non è stata verificata sistematicamente la capacità di tali marcatori di distinguere le cellule T antigene-specifiche da quelle attivate in modo bystander.
Lo scopo di questo lavoro è determinare quale AIM o quale combinazione di AIMs, tra quelli più comunemente utilizzati in letteratura (CD25, CD38, CD40L, CD69, CD137, HLA-DR, ICOS, OX40 e PD-1), è più efficace nell’identificare i linfociti T attivati e nel distinguere quelli antigene-specifici da quelli bystander, sia da un punto di vista qualitativo che quantitativo. Per raggiungere tale obiettivo abbiamo messo a punto un sistema sperimentale per riprodurre in-vitro l’attivazione TCR-mediata (o antigene-specifica) e bystander di linfociti T umani isolati da buffy-coats prelevati da donatori sani. In seguito, abbiamo quantificato per ciascun AIM o per selezionate coppie di AIMs alcuni parametri in grado di misurare matematicamente la bontà di un test predittivo. Questi parametri sono: sensibilità, specificità, accuratezza e valore predittivo positivo. In particolare, il valore predittivo positivo è il parametro principale che indica la capacità degli AIMs di distinguere l’attivazione antigene-specifica da quella bystander. Per validare la misurazione di tale parametro, abbiamo isolato le cellule proliferanti AIM-positive in seguito ad una stimolazione antigene-specifica, espanso in-vitro un elevato numero di singoli cloni di cellule T e testata la loro effettiva specificità tramite ri-stimolazione con lo stesso antigene.
I risultati di tale lavoro forniscono ai ricercatori un concreto strumento per valutare in modo consapevole la migliore strategia per identificare in-vitro e, potenzialmente, ex-vivo i linfociti T umani antigene-specifici, sia che si voglia favorire la resa quantitativa che prioritizzare, invece, l’arricchimento rispetto ai linfociti T attivati in modo antigene-indipendente.
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Abstract
During an immune response, T lymphocytes can be activated either by the antigen for which they are specific (antigen-specific activation) or by antigen-independent stimuli, such as certain cytokines produced under inflammatory conditions (bystander activation). Since only the first activation mode depends on the specificity of individual T cell clones, being able to distinguish between T lymphocytes activated by the two different types of stimuli is crucial for dissecting the immune response to a specific antigen. Several activation-induced markers (AIMs) have been described in the literature, but their characterization is mainly qualitative and not quantitative. Furthermore, the ability of these markers to distinguish antigen-specific from bystander-activated T cells has not been systematically verified.
The aim of this work is to determine which AIM or which combination of AIMs, among those most commonly used in the literature (namely, CD25, CD38, CD40L, CD69, CD137, HLA-DR, ICOS, OX40, and PD-1), is most effective in identifying activated T lymphocytes and distinguishing antigen-specific from bystander T lymphocytes, both qualitatively and quantitatively. To achieve this goal, we developed an experimental system to reproduce in-vitro TCR-mediated (or antigen-specific) and bystander activation of human T lymphocytes isolated from buffy-coats from healthy donors. Subsequently, we quantified for each AIM or selected pairs of AIMs some parameters that can mathematically measure the goodness of a predictive test. These parameters are: sensitivity, specificity, accuracy, and positive predictive value. In particular, the positive predictive value is the main parameter indicating the ability of AIMs to distinguish antigen-specific from bystander activation. To validate the measurement of this parameter, we isolated AIM-positive proliferating cells following an antigen-specific stimulation, expanded a large number of individual T cell clones in-vitro, and tested their specificity by re-stimulation with the same antigen.
The results of this work provide researchers with a concrete tool to consciously evaluate the best strategy to identify in-vitro and, potentially, ex-vivo antigen-specific human T lymphocytes, whether to favor quantitative yield or to prioritize the enrichment over bystander-activated T lymphocytes.
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