Riassunto analitico
Il polietilene tereftalato (PET) è uno dei materiali plastici più diffusi al mondo. Grazie alla sua durabilità, bassa permeabilità ai gas e trasparenza, Il PET si è imposto nel mercato del packaging e nell’industria tessile.
Tuttavia, le possibilità per il suo smaltimento sono limitate ed estremamente costose, e in tale ambito notevoli progressi sono stati riscontrati grazie alla ricerca biotecnologica: gli ultimi anni hanno visto la scoperta di vari enzimi in grado di catalizzare l’idrolisi del PET.
Nel 2016, il gruppo di Yoshida et al. ha isolato il batterio chiamato Ideonella Sakaiensis 201-F6, in grado di idrolizzare film di PET a bassa cristallinità a 30°C grazie a due enzimi nominati PETasi e MHETasi.
Sin dalla la loro scoperta, la maggior parte degli studi sono stati dedicati alla elucidazione di struttura e proprietà peculiari della PETasi, da un punto di vista sia sperimentale che computazionale.
La sua struttura mostra il folding tipico di una α/β-idrolasi: l’idrolisi è esercitata da una triade catalitica altamente conservata composta da Ser133-His210-Asp179.
Le migliori prestazioni dell’enzima sono imputate a significative differenze strutturali nella PETasi rispetto ad altri enzimi omologhi, come la presenza di un legame disolfuro addizionale, un loop esteso, un residuo di Trp altamente flessibile nel sito attivo o la sostituzione di alcuni aminoacidi con catene laterali più piccole e idrofobiche nel sito di legame del substrato.
È supposto che tali caratteristiche forniscano una più ampia e idrofobica regione di rispetto alle altre idrolasi omologhe, in grado di accomodare il substrato polimerico e scinderne la catena a temperatura ambiente.
Pertanto, PETasi è stata selezionata come promettente candidato per l’applicazione industriale, ma vari autori hanno evidenziato la necessità di ottimizzare il suo grezzo sito di legame che causa una bassa stabilità termica e scarsa affinità verso substrati ad elevata cristallinità.
In questa tesi sono descritte le strategie adottate dai diversi gruppi di ricerca per investigare approfonditamente struttura e funzionalità dell’enzima, finalizzate a individuare i residui più rilevanti da modificare attraverso la protein engineering.
Il meccanismo catalitico è stato studiato attraverso il docking di un appropriato modello di substrato nel sito di legame, supportato da simulazioni di Dinamica Molecolare e testato con esperimenti di mutagenesi sito specifica.
Risultati molto promettenti sono stati ottenuti con una variante in grado di raggiungere una temperatura di fusione fino a 31°C più elevata rispetto la sua forma wild type, e un’efficienza 400 volte superiore nell’idrolisi di PET ad elevata cristallinità.
Nella seconda parte della trattazione è introdotta la MHETasi, sebbene gli studi focalizzati su tale enzima siano ancora privi di un supporto computazionale.
MHETasi è una α/β-idrolasi la cui attività è esercitata dalla triade catalitica composta da Ser225 - His528 - Asp492. Le peculiarità del sito di legame sono localizzate nel dominio a coperchio: stabilizza il substrato attraverso un network di legame a idrogeno, interazioni idrofobiche con la regione aromatica e contatto ravvicinato dei due ossigeni carbossilici del substrato con la catena laterale di Arg411, che caratterizza l’elevata specificità di MHETasi.
Tuttavia, ulteriori studi hanno rivelato che l’enzima può anche esercitare una funzione come BHETasi e eso-PETasi.
I promettenti risultati ottenuti con la protein engineering incoraggiano a rendere prioritari gli sforzi in questo prolifico campo di ricerca, per rendere gli enzimi determinanti sia in ambito industriale che per affrontare alcuni significativi problemi ambientali, come il trattamento delle acque per la degradazione di micro e nanoplastiche.
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Abstract
Polyethylene terephthalate (PET) is one of the most spread plastic materials worldwide. Due to its durability, low permeability to gases and transparency, PET imposed itself in packaging market and textile industry.
However, its recycling is limited and highly energy consuming and remarkable progress has been achieved by biotechnological research: the past few years have witnessed the discovery of several enzymes able to catalyze PET hydrolysis.
In 2016, the group of Yoshida et al. isolated a bacterium strain named Ideonella Sakaiensis 201-F6, able to hydrolyze low-crystallinity PET films a 30°C thanks to two enzymes named PETase and MHETase.
After their discovery, most efforts were dedicated to the elucidation of structure and peculiar features of PETase, which was studied by several research group both on an experimental and computational point of view.
Its structure shows a folding typical of a α/β-hydrolase: the catalytic function is exerted by the highly conserved catalytic triad and composed by Ser133-His210-Asp179.
However, crucial differences are found in PETase in comparison with other PETase-like enzymes, such as the presence of an additional disulphide bond, an extended loop, a highly flexible Trp residue located in the active site or the replacement with smaller and hydrophobic side chains in the substrate binding cleft.
These features are supposed to provide a wider and more hydrophobic region than other homolog hydrolases, able to accommodate the polymeric substrate and to cleave its chain at room temperature.
Therefore, PETase was selected as a promising candidate for the industrial application but various authors highlighted the necessity to optimize its rough substrate binding site, that causes a low thermal stability and poor affinity towards high crystallinity substrate.
In this essay, strategies adopted by different research groups to deeply investigate the structure and the functionality of the enzyme are described and, subsequently, the modifications implemented with protein engineering are discussed.
The catalytic mechanism was studied by docking a proper model of the substrate within the substrate binding site, supported by Molecular Dynamics simulations, and tested via site-directed mutagenesis experiments.
Very promising results were obtained with a variant able to achieve melting temperature up to 31°C higher than its wild type form and a 400-fold higher efficiency towards high-crystallinity PET.
In the second part of the dissertation, MHETase is introduced for a reason of completeness. Its crystal structure was solved very recently and the studies that focused on the enzyme still lack a computational support.
MHETase is a α/β-hydrolase which activity is exerted by the catalytic triad Ser225 - His528 - Asp492. Most differences with respect to its homologous enzymes were found in the lid domain: it stabilizes the substrate within the binding site via a strong hydrogen bond network, hydrophobic interactions with the aromatic moiety and a close contact of two carboxylated oxygens of the substrate with the Arg411 side chain, which characterizes the high substrate-specificity of MHETase.
However, further studies revealed that the enzyme could also exert a BHETase and an exo-PETase function.
The promising results achieved with protein engineering on both PETase and MHETase are predicted to become determinant for some industrial application and for tackling some huge environmental issues, such as the treatment on wastewater for the degradation of microplastics and nanoplastics.
The versatility of the enzymes secreted by Ideonella Sakaiensis enables to predict that they will find several applications in the disposal of PET debris, encouraging to prioritize the efforts in this prolific research field.
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