Riassunto analitico
Recenti scoperte nel campo delle terapie cellulari, basate sulla cultura di cellule staminali somatiche, hanno generato la nascita di numerosi dispositivi a sostegno della medicina rigenerativa. Da qui è nata la necessità di valutare l'efficacia e la sicurezza di questi materiali. Svariati modelli animali sono stati sviluppati, al fine di valutare tali terapie avanzate. Tuttavia, il modello animale perfetto non esiste; c'è sempre un'incongruenza quando si passa all'uomo. Al fine di ottenere risultati più predittivi, devono essere usate cellule autologhe umane nei test preclinici in vitro. Solo un sistema consolidato di coltura cellulare può dare forza ai dati preclinici diventando così un vero e proprio modello in vitro. Un esempio è dato da un test in vitro per valutare la tossicità di una colla per la ricostruzione chirurgica dell'uretra, in caso di stenosi. Il restringimento rende difficile la minzione, danneggia la funzionalità della vescica e può causare infezioni, si rende così necessaria l'uretroplastica. Questa procedura richiede un tessuto sano per la riparazione, un innesto autologho prelevato dalla cavità orale. Il lavoro pionieristico di Rheinwald e Green ha reso possibile la coltivazione di cheratinociti umani utilizzando un feeder layer di cellule 3T3-J2 letalmente irradiate, introducendo così una condizione insostituibile per la terapia cellulare a base di cellule staminali epiteliali. In questo studio, sfruttando queste tecnologie, abbiamo valutato l'effetto biologico di una colla chirurgica a base di cianoacrilato in un modello di coltura di fibroblasti e di epiteli uretrale e di mucosa. Una colla biologica tessutale (colla di fibrina), già utilizzata in clinica, è stato usata come controllo. Biopsie di uretra bulbare e di mucosa orale sono state ottenute da pazienti durante la chirurgia ricostruttiva, previo consenso informato. Le cellule epiteliali di uretra e mucosa orale sono state coltivate come descritto da Corradini et al. nel 2015 e i fibroblasti sono stati isolati da espianto e coltivati su plastica. La citotossicità è stata valutata sulle cellule dopo l'esposizione al cianoacrilato e alla colla a base di fibrina. Le culture sono state sottoposte a analisi d'immagine subito dopo il contatto e fino a 47 giorni, mentre la vitalità cellulare è stata quantificata a 24 ore e a 7 giorni. Gli effetti a lungo termine sui fibroblasti e sugli epiteli sono stati valutati attraverso subcolture e con il test di efficienza di formazione di colonie (CFE), rispettivamente. Le colture di fibroblasti esposte alla colla cianoacrilica, hanno mostrato un alone privo di cellule che circonda la colla, suggerendo una certa citotossicità. L'alone è diminuito nel tempo nelle culture epiteliali e di fibroblasti fino alla completa scomparsa, in 8 e 7 giorni rispettivamente. Le colture in contatto con la colla di fibrina non hanno mostrato né alone né tossicità. L'area della colla polimerizzata, in 47 giorni, è stata ridotta fino al 20% nei fibroblasti uretrali e al 10% in quelli di mucosa orale. L'analisi della vitalità e della morfologia dopo il contatto con le colle a 24 ore e 7 giorni non ha mostrato differenze significative. Entrambe le subcolture analizzate a 24h, 4 e 8 giorni dopo il ripiastramento, non mostravano differenze nel numero di cellule morte.
Si nota che gli epiteli di uretra e di mucosa orale hanno evidenziato una tossicità transitoria nella vitalità cellulare dopo il contatto con la colla cianoacrilica. L'effetto a lungo termine ha mostrato un recupero di questa citotossicità valutata con il test CFE. Lo studio dimostra che la colla di cianoacrilato, ha solo un effetto tossico transitorio sia nelle cellule di uretra che in quelle di mucosa orale, sostenendo così la sua applicazione nella ricostruzione uretrale.
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Abstract
Recent breacktroughs in cellular therapies, based on autologous culture of somatic stem cells, have generated the birth of many devices in support to this new stem cell-based regenerative medicine. Hence the need of assessing safety and efficacy of these materials, is increased. A plethora of animal models have been developed over years in order to evaluate those advanced therapies and related medical devices for clinical application. Nevertheless the perfect animal model does not exists; there is always an incongruity when we switch to the human. In order to obtain more predictive results, human autologous cells should be used for in vitro preclinical assays mimicking the human condition. Only a consolidated system of cell culture, with standardized conditions can give strength to preclinical data, becoming an in vitro tissue culture model. An example is provided by an in vitro test to assess the toxicity of a glue for surgical reconstruction of urethra, in case of stricture. This narrowing makes urination difficult, can impair bladder function and allow infections leading to a surgical reconstruction by urethroplasty. This procedure, requires healthy tissue for the repair, such as autologous grafts taken from the oral cavity. Rheinwald and Green pioneering work made possible the cultivation of human keratinocytes using a feeder layer of lethally irradiated 3T3-J2 cells, introducing a somewhat irreplaceable condition for epithelial stem cell-mediated cell therapy. In this study, taking advantage from these technologies, we evaluated the biological effect of cyanoacrilic-based surgical glue, made of N-butyl-2-cyanoacrylate and methacryloxysulfolane, in a cell culture model of fibroblasts and epithelia of urethral and mucosa. A biological tissue adhesive (fibrin glue), already used in clinic, was used for comparison, as a control. Biopsies from bulbar urethra and oral mucosa were obtained from patients during reconstructive surgery, after informed consent. Urethral and oral mucosa epithelia were cultured as described by Corradini et al. in 2015 and fibroblasts were isolated by explant and cultivated on plastic. Cytotoxicity was evaluated on both epithelial and fibroblast cells by exposure to cyanoacrilic- and fibrin-based glue. All cultures underwent digital image analysis soon after contact and up to 47 days, whereas cell viability was quantified at 24 h, and 7 days. Long term effects on fibroblasts and epithelia were assessed by subculturing cells and by colony forming efficiency assay, respectively. Fibroblast cultures exposed to cyanoacrylic-based glue showed an halo devoid of cells surrounding the glue area, suggesting some cell toxicity. The halo diminuished over time in both urethral and mucosa cultures up to complete disappearence, in 8 and 7 days respectively. Cultures in contact with fibrin glue did not show any halo or toxicity. The area of the polymerized glue, in 47 days, was reduced up to 20% by urethral and 10% by oral mucosa fibroblasts. The analysis of viability and morphology after contact with both glues at 24h and 7 day did not show a significant difference. Moreover both subcultures analysed at 24h, 4 and 8 days after replating, showed no differences in the number of dead cells.
It should be noted that urethral and oral mucosa epithelia highlighted a transient toxicity on viability after cyanoacrylic-based glue contact. The long term effect showed a rescue of this cytotoxic effect, as assessed by colony foming efficiency assay. This study demonstrate that cyanoacrylic-based surgical glue have only a transient toxic effect on both bulbar urethra and oral mucosa cells, supporting its safe application in urethral reconstruction.
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