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Gli ormoni tiroidei (T3 e T4) (THs) vengono prodotti dalla tiroide e il loro rilascio è controllato dall'asse ipotalamo-ipofisi-tiroide. Tali ormoni sono essenziali per il corretto funzionamento di molti sistemi sia nella fase di sviluppo che nell'adulto. Il cervello è un bersaglio importante dei THs ed uno squilibrio dei livelli di questi ormoni provoca alterazioni profonde della sua funzionalità. Infatti, il distiroidismo (ipo- e iper-tiroidismo) è spesso associato con diverse patologie neuropsichiatriche. I meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti sono ancora sconosciuti. Per questa ragione abbiamo voluto studiare in vitro l'azione dei THs sull'attività neuronale. T3 e T4 possono mediare i loro effetti legandosi a recettori nucleari (effetti genomici) oppure a recettori di membrana (effetti non genomici).
Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che i THs modulano la trasmissione GABAergica e glutammatergica attraverso meccanismi non genomici (Losi et al., 2008; Puia et al., 2011).
Lo scopo della mia tesi è stato quello di identificare il meccanismo molecolare alla base della modulazione di tali ormoni a livello di recettore GABAA.
Il GABA è il principale neurotrasmettitore inibitorio presente nel sistema nervoso centrale. Il recettore GABAA è una proteina canale la cui attivazione dipende dal GABA, che è il principale agonista, ma anche da altre molecole che agiscono con diversa efficacia, come la taurina e la b-alanina o il THIP (4,5,6,7-tetraidroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-olo). Numerosi farmaci di notevole importanza clinica e sostanze endogene modulano l'attività del recettore GABAA come le benzodiazepine (BZ), i barbiturici, l'etanolo e i neurosteroidi (Allopregnenolone, THDOC, Pregnenolone solfato).
Metodi: Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'utilizzo della tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell in colture primarie di neuroni corticali di ratto e su cellule HEK293 stabilmente trasfettate con le subunità a1b2g2 del recettore GABAA.
Risultati: I THs riducono la risposta GABAergica sia a livello di attività sinaptica (sIPSCs) che di correnti GABA evocate. I nostri esperimenti dimostrano che gli ormoni tiroidei esercitano una modulazione simile sulla corrente evocata dal GABA, taurina e b-alanina. L'effetto del T3, ma non del T4, è invece significativamente ridotto quando il recettore viene ad essere attivato dal THIP. La modulazione del T3 e del T4 a livello del recettore GABAA è stata comparata a quella del composto endogeno Pregnenolone solfato al fine di evidenziare similitudini nel meccanismo d'azione.
Studi precedenti hanno messo in evidenza che le concentrazioni intracellulari di Ca2+ e la fosforilazione di specifiche proteine sono importanti per l'effetto rapido non genomico degli ormoni. Dai nostri esperimenti risulta che la modulazione dei THs non è influenzata dalla cheleritrina (inibitore della PKC) nè dal H89 (bloccante della PKA) né dall'applicazione intracellulare del peptide inibitorio dell'isoforma e della PKC. Inoltre l'applicazione di BAPTA (acido 1,2-bis(o-aminofenossi)etano-N,N,N',N'-tetraacetico), chelante del Ca2+, o di TETRAC (acido tetraidotiroacetico), antagonista del recettore integrina avb3, non modifica l'azione degli ormoni. L'applicazione di T3 e di T4 all'interno della cellula non ha prodotto alcun effetto modulatorio sulle correnti GABA-evocate suggerendo che i siti per l'azione degli ormoni si debbano trovare sul lato esterno della membrana plasmatica.
Conclusioni: I nostri dati suggeriscono che la modulazione esercitata dagli ormoni tiroidei sulla corrente GABAergica sia dovuta ad una interazione diretta di queste molecole sul recettore GABAA in un sito, probabilmente extracellulare, che non è stato ancora identificato.

Thyroid hormones (T3 and T4)(THs) are produced by thyroid gland and their release is under the control of hypothalamus-pituitary-thyroid axis. These hormones are essential for the correct functioning of several systems both in development and in adulthood. Brain is an important target of THs, as proved by the profound alterations in its functionality related to hormonal imbalance. Indeed, dysthyroidism (hypo- or hyper-thyroidism) is often associated with several neuropsychiatric disorders. The molecular mechanisms responsible for these changes are not completely clarified yet. For this reason we decided to study in vitro THs' activity on neuronal transmission. T3 and T4 can mediate their effects by binding to nuclear receptors (genomic effects) or to membrane receptors (non genomic effects). Our laboratory previously demonstrated that THs modulate GABAergic and glutamatergic transmissions by non genomic mechanisms (Losi et al., 2008; Puia et al,. 2011). The aim of my thesis was to identify the molecular mechanisms responsible for thyroid hormones modulation at the GABAA receptor level. GABA is the major inhibitory neurotransmitter in the SNC. GABAA is a channel protein whose activation depend on GABA, that is the principal agonist, but there are also other molecules that can activate with different efficacy the receptor such as taurine , b-alanine or THIP (4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-ol). Several clinically relevant drugs and endogenous substances modulate the GABAA receptor activity such as benzodiazepines (BZs), barbiturates, ethanol and neurosteroids (Allopregnenolone, THDOC, Pregnenolone sulfato). Methods: All the experiments were performed using the patch-clamp technique in whole-cell configuration in primary cultures of rat cortical neurons and in HEK293 cells stable transfected with GABAA receptor subunits (a1b2g2). Results: THs reduce synaptic (sIPSCs) and evoked GABAergic currents. Our experiments show that THs exert similar modulation on the current evoked by GABA, taurine, b-alanine . Conversely T3' effect , but not T4', is significatively reduced when the receptor is activated by THIP. T3 and T4 modulation was compared to that of an endogenous substance, i.e. Pregnenolone sulfate, to make light on the possible similarity in their mechanism of action at the level of GABAA receptor. Previous works showed that intracellular Ca2+ concentrations or phosphorylation of specific protein are important for the rapid effect of the hormones. Our results show that the modulation by THs is not affected by cheleritrine (a PKC inhibitor), by H89 (a PKA blocker) or by intracellular perfusion of an inhibitor peptide of the isoform e of the PKC. Additionally BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), a calcium chelator, and TETRAC, an integrin avb3 antagonist, don't change THs activity. Intracellular application of T3 and T4 has no modulatory effect on GABA-evoked current suggesting that the sites for THs action should face the extracellular side of the plasmamembrane. Conclusions: We propose that THs modulation of the GABAergic neurotransmission derive from a direct interaction of these molecules with the GABAA receptor protein in a site, probably extracellular, that should still be identify.