Riassunto analitico
Introduzione. Nei pazienti sottoposti a trapianto di fegato (TF) trattati con farmaci immunosoppressori le infezioni rimangono la causa principale di morbosità/mortalità. È quindi cruciale comprendere quali siano le alterazioni a carico dell’immunità cellulo-mediata dopo TF soprattutto in casi particolari come nei pazienti con infezione da HIV per cercare di diminuire il rischio di infezioni con nuove strategie. In questo studio è stata quindi condotta un’analisi funzionale e fenotipica dei linfociti T in pazienti sottoposti a TF. Metodi. Lo studio prevede l’arruolamento di 25 pazienti per gruppo: HIV+ sottoposti a TF; HIV+ comparabili per sesso, età e numero di CD4; HIV negativi sottoposti a TF comparabili per sesso, età, regime immunosoppressivo e tempo intercorso dal TF; controlli sani (CTR) comparabili per sesso ed età. I linfomonociti di sangue periferico sono stati stimolati per 16 ore con PepMix BKV (Large T antigen), PepMIX C. albicans (MP65), PepMix CEFT Pool, PepMix HCMVA (UL32), PepMix VACV (MVA 074R) (JPT, Berlin, Germania), S. aureus enterotossina B (SEB) e anti-CD3/CD28/CD49d. Dopo stimolazione in vitro, le cellule sono state marcate con AQUA Live/Dead e anticorpi monoclonali (m-Ab) anti-CD3 PE-Cy5, -CD4 AF700, -CD8 APC-Cy7, -CD45RA PE, -CCR7 BV421 (Biolegend, CA-USA). La produzione di citochine è stata valutata tramite marcatura intracellulare con mAb: IL-2-APC, IL-17-PE-Cy7, TNF-BV605, IFN--FITC (Biolegend). Le analisi sono state condotte mediante un citofluorimetro Attune NxT (Thermo Fisher, USA). Risultati. A oggi sono stati arruolati 22 pazienti HIV+ TF (2 combinati fegato-rene), 21 CTR e 9 HIV+. Tra i TF 16 (73%) assumevano tacrolimus, 2 (9%) ciclosporina, 2 (9%) everolimus, 1 (5%) sirolimus e 1 (5%) rapamicina. Tre pazienti effettuavano ancora terapia con steroidi a scalare (TF effettuato meno di 2 mesi prima del prelievo). 27 pazienti HIV+ (21 TF, 6 non-TF) erano in terapia antiretrovirale con un regime con inibitori delle integrasi, 3 non-TF con darunavir e 1 TF con rilpivirina. L’indicazione al TF era HCC/HCV in 6 pazienti (29%), HCV in 4 (19%), HBV/HCV/HCC in 3 (14%), HBV/HDV in 2 (10%), HBV/HCV in 2 (10%), HBV/HCV/HDV/HCC in 2 (10%), NASH in 1 (5%) e HCV/HBV/HDV in 1 (5%). Tutti i pazienti con HCV avevano già ottenuto una risposta virologica sostenuta al prelievo. La mediana della conta dei CD4 era 477 cells/uL (range 347-564) nei TF e 571 cells/uL (range 552-691) negli altri pazienti HIV+. Tutti i pazienti avevano carica virale soppressa per HIV. Il tempo mediano intercorso tra TF e prelievo era di 1,112 giorni (IQR 455-2,496) e nessun paziente presentava infezioni al prelievo. Come atteso, la percentuale di linfociti T CD4+ è inferiore nei TF rispetto ai CTR, mentre la percentuale dei linfociti T CD8+ è più elevata. TF e CTR mostrano una distribuzione simile dei diversi sottogruppi di linfociti T (naïve, central memory, effector memory) ma i TF hanno una percentuale inferiore di linfociti T CD8 naïve (43.7%, SEM 4.5 e 57.3%, SEM 7.3, p<0.05). Rispetto ai CTR, i TF mostrano una percentuale più elevata di linfociti T CD4+ in grado di produrre IL-2 (0.7% SEM 0.3 e 0.1%, SEM 0.01, p<0.05) e di linfociti T CD8+ in grado di produrre TNF-⍺e IFN- dopo stimolazione con SEB e con anti-CD3/CD28/CD49d (1.0%, SEM 0.2 e 0.4%, SEM 0.2, p<0.05; 4.8%, SEM 1.0 e 2.2%, SEM 0.4, p<0.05 rispettivamente). Conclusioni. I linfociti T di pazienti HIV positivi sottoposti alla terapia anti-rigetto sono in grado di rispondere a stimoli esterni sia con attività helper sia citotossica. Questo suggerisce che un adeguato controllo dell’attivazione immunitaria, valutabile mediante citometria a flusso, nei pazienti sottoposti a TF non solo sia in grado di prevenire il rigetto dell’organo, ma anche di controllare gli episodi infettivi.
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Abstract
Introduction. In patients undergoing liver transplant (LT), immunosuppressive (IS) treatment is mandatory and infections are the leading cause of morbidity/mortality. Thus, it is essential to understand the functionality of cell-mediated immunity after LT and which alterations can increase the infection risk. For this reason, we studied T cell subsets and functionality in these patients, comparing HIV positive and HIV negative patients.
Methods. We plan to enrol a total of 25 patients for each of the following group: HIV+ patients who underwent LT; HIV negative patients who underwent LT, matched for age, sex, immunosuppressant regimen and time between LT and sample; age-, CD4-, and sex-matched HIV+ non-transplanted patients; age- and sex-matched healthy subjects (CTR). Freshly isolated PBMC were stimulated with PepMix BKV (Large T antigen), PepMIX C. albicans (MP65), PepMix CEFT Pool, PepMix HCMVA (UL32), PepMix VACV (MVA 074R), all from JPT (Berlin, Germany), S. aureus enterotoxin B (SEB) and anti-CD3/CD28/CD49d for 16 hours. After in vitro stimulation, cells were stained with AQUA Live/Dead, and anti-CD3 PE-Cy5, -CD4 AF700, -CD8 APC-Cy7, -CD45RA PE, -CCR7 BV421 mAbs (Biolegend, CA-USA). Cells were fixed and permeabilized with Fixation/Permeabilization Solution Kit (Becton Dickinson, CA-USA). Cytokine production was assessed by intracellular staining by using mAbs recognizing IL-2-APC, IL-17-PE-Cy7, TNF-BV605, IFN--FITC (all from Biolegend). A minimum of 5 million cells were acquired by using Attune Net (Thermo Fisher, USA)
Results. 22 HIV+ patients who underwent LT (2 combined kidney-liver transplant), 21 CTR, and 9 HIV+ non-LT patients were enrolled until now. Among LT patients, 16 (73%) had tacrolimus as anti-rejection treatment, 2 (9%) cyclosporine, 2 (9%) everolimus, 1 (5%) sirolimus, and 1 (5%) rapamycin. Three of them were still tapering steroids after LT (LT less than 2 months before sample). Integrase inhibitor based regimens were ongoing in 27 patients (21 in LT and 6 in non-LT respectively). The other 4 had DRV based (3 non-LT) and RPV based regimens (1 LT). LT indication was HCC/HCV in 6 patients (29%), HCV in 4 (19%), HBV/HCV/HCC in 3 (14%), HBV/HDV in 2 (10%), HBV/HCV in 2 (10%), HBV/HCV/HDV/HCC in 2 (10%), NASH in 1 (5%), and HCV/HBV/HDV in 1 (5%). All patients with HCV infection had already obtained a sustained virological response at enrolment. The median CD4 count in LT was 477 cells/uL (range 347-564) in HIV+, 571 cells/uL (range 552-691) in non-LT patients. All patients had undetectable HIV-viral load. The median time between LT and enrolment was 1,112 days (IQR 455-2496), and no infective events were present at sample.
The percentage of CD4+ T cells was lower in LT patients if compared to CTR, while percentage of CD8+ T cells were higher. LT and CTR had a similar distribution of different T cell subsets (naïve, central memory, effector memory) but LT had a lower percentage of CD8+ naïve T cells (43.7%, SEM 4.5 and 57.3%, SEM 7.3, p<0.05). After stimulation with SEB or anti-CD3/CD28/CD49d, transplanted patients show higher percentage of CD4+ T cells able to produce IL-2 (0.7%, SEM 0.3 e 0.1% SEM 0.01, p<0.05). The percentage of CD8+ T cells producing TNF-⍺and IFN-was higher in LT patients if compared to CTR (1.0%, SEM 0.2 and 0.4%, SEM 0.2, p<0.05; 4.8%, SEM 1.0 and 2.2%, SEM 0.4, p<0.05 respectively).
Conclusions. Cells from patients with severe immune alterations due either to HIV infection or anti-rejection therapy are still capable of responding to external stimuli and exert helper and cytotoxic activities. It is tempting to speculate that an adequate control of immune activation, that can be monitored by flow cytometry, not only can inhibit the transplant rejection, but also avoid infection development.
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