• ABCB5
• LSC
• LSCD
• p63
• transplantation

L'epitelio corneale si rinnova ogni 9-12 mesi. Per realizzare il suo processo di auto-rinnovamento, l'epitelio corneale si basa sulla presenza di cellule staminali e transient amplifying, che sono le uniche cellule con capacità proliferativa in un tessuto normale. Le cellule staminali dell'epitelio corneale sono localizzate nel limbus, tra cornea e congiuntiva bulbare.
Numerosi potenziali marcatori di cellule staminali limbari (LSC) sono stati proposti, ma, per la maggior parte, al momento non sono disponibili evidenze che permettano un arricchimento prospettico di cellule in grado di ripristinare la cornea a lungo termine. Solo il fattore di trascrizione p63 è un marcatore affidabile di LSC perchè è l'unico che è stato correlato alla staminalità in modo funzionale. L'espressione di ΔNp63α in LSCs ha reso possibile stimare prospetticamente il numero di cellule staminali in un lembo di epitelio corneale coltivato, senza la necessità di analisi clonale, con importanti implicazioni nel trattamento delle malattie oculari, come il deficit di cellule staminali limbari (LSCD).
Tuttavia, alcuni gruppi di ricerca si sono concentrati sulle proteine di membrana per trovare un marker di superficie, che possa consentire di effettuare un sorting delle cellule staminali limbari. Inoltre, un marcatore di superficie ha il vantaggio di non danneggiare la cellula quando viene rilevato, quindi consente di conoscere in tempo reale il numero esatto di cellule staminali in un campione. Nel 2014 Ksander et al. hanno dimostrato che ABCB5 marca le cellule staminali limbari ed è necessario per il mantenimento, lo sviluppo e la rigenerazione della cornea. Inoltre, nel loro lavoro hanno mostrato che LSCs ABCB5+ murine o umane isolate hanno l'esclusiva capacità di ripristinare completamente la cornea dopo essere state trapiantate in topi immunodeficienti, in cui era stata indotta la LSCD, in modelli di trapianto singenici e xenogenici. Per questi motivi, ABCB5 è stato proposto come marcatore di LSCs.
Partendo da alcune incongruenze presenti nel lavoro di Ksander et al., abbiamo analizzato l'espressione e la funzione di ABCB5 nel limbus umano per esaminare se ABCB5 possa essere considerato un marcatore di LSCs. Inoltre, abbiamo esteso l'analisi ad altri epiteli di rivestimento umani, come pelle, trachea, mucosa orale e uretra.
L'espressione di ABCB5 è stata comparata a quella di ΔNp63α e di marcatori del differenziamento (K12, involucrina) in immunofluorescenze e western blot sui campioni di limbus. I nostri risultati mostrano che ABCB5 non può essere considerato un marcatore di LSCs perchè non correla con la localizzazione di tali staminali e la sua espressione aumenta nella transizione da un passaggio giovane a uno vecchio in coltura. Inoltre, le immunofluorescenze e i western blot condotti sui campioni degli altri epiteli di rivestimento umani rivelano che ABCB5 non può essere nemmeno considerato un marcatore delle cellule staminali degli altri epiteli di rivestimento.
Per investigare la funzione di ABCB5 nel limbus umano, abbiamo messo a punto esperimenti di silenziamento usando siRNA contro ABCB5 nelle SK-Mel-28, linea di melanoma che esprime alti livelli di ABCB5, al fine di valutare l'efficienza dei siRNAs nel ridurre i livelli di ABCB5 e selezionare il protocollo più efficiente. Il silenziamento riduce significativamente i livelli di ABCB5.

The corneal epithelium is renewed in 9-12 months. To accomplish its self-renewal process, this epithelium relies on the presence of stem and transient amplifying cells, which are the only proliferative cells in a normal tissue. Stem cells of the corneal epithelium are located in the limbus, the narrow zone between cornea and bulbar conjunctiva. Numerous potential limbal stem cell (LSC) markers have been proposed, but for most of them, evidence for successful prospective enrichment of cells capable of long-term corneal restoration is currently lacking. Only the p63 transcription factor is a reliable marker for LSC because is the only one related to stem function. The expression of ΔNp63α in LSC made it possible to prospectively estimate the number of stem cells in a cultured limbal graft, without the need for clonal analysis, with important implications in the treatment of ocular diseases, such as limbal stem cell deficiency (LSCD). However, some research groups focused on membrane protein in order to discover a surface marker, which could enable limbal stem cells sorting. Moreover, a surface marker has the advantage of not damaging the cell when it is detected, hence it allows to know in real time the exact number of stem cells in a sample. In 2014 Ksander et al. showed that ABCB5 marks LSCs and is required for their maintenance, corneal development and regeneration. Furthermore, they demonstrated that prospectively isolated human or murine ABCB5+ LSCs have the exclusive ability to fully restore the cornea upon grafting to LSC-deficient mice in xenogeneic or syngeneic transplantation models. For these reasons, ABCB5 was proposed as a LSC marker. Since many inconsistencies arose in previous ABCB5 investigation, we analysed ABCB5 expression and function in human limbus to examine whether ABCB5 could be considered as a LSC marker. Moreover, we extended the analysis to other human lining epithelia, such as skin, trachea, oral mucosa and urethra. ABCB5 expression was compared to ΔNp63α and differentiation markers (K12, involucrin) expression by means of immunofluorescence and western blot analyses on limbus samples. Our results show that ABCB5 cannot be considered as a LSC marker because it does not correlate with the stem cell location. Moreover, its expression increases in the transition from young to old cell culture passages. In addition, immunofluorescence and western blot analyses in the other human lining epithelia reveal that ABCB5 cannot be neither considered a stem cell marker of skin, tracheal, oral mucosa, and urethral epithelia. Finally, to investigate ABCB5 function in human limbus, we decided to knock down ABCB5 expression in order to examine if ABCB5 loss leads to a modulation of other markers and changes in stem cell behaviour. To reduce ABCB5 expression levels, cell culture transfection with siRNAs was performed. The experimental set up was carried out in human melanoma SK-Mel-28 cell line, an ABCB5 positive control, in order to evaluate the siRNAs efficiency to decrease ABCB5 expression and select the most efficient method. Silencing significantly reduces ABCB5 expression levels.