Riassunto analitico
Heat Shock Protein 90 (Hsp90) è uno chaperone molecolare ad attività ATP-dipendente. Il suo ruolo fisiologico principale è di aiutare il refolding di proteine denaturate in risposta a condizioni di stress o ad alte temperature, al fine di evitare l’accumulo di aggregati potenzialmente tossici all’interno della cellula. L’istone deacetilasi 6 (HDAC6) è una proteina che appartiene alla classe IIb della famiglia delle HDAC, localizzata principalmente nel citoplasma cellulare, associata ai microtubuli; la sua funzione principale è la deacetilazione del residuo lisina 40 della subunità α della tubulina, partecipando così alla regolazione dell’equilibrio dinamico dei microtubuli. Studi ed evidenze cliniche hanno dimostrato che Hsp90 ed HDAC6 sono spesso deregolate o sovra espresse in diverse tipologie di tumore, dove favoriscono processi come la tumorigenesi, la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali e la metastatizzazione. L’inibizione simultanea di questi due target può promuovere effetti terapeutici sinergici in alcuni tipi di tumore, tra cui il cancro alla prostata. Sulla base di queste premesse, l’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato l’identificazione di potenziali inibitori duali di Hsp90 e HDAC6. A tal fine, è stata effettuata dapprima un’analisi strutturale degli inibitori noti dei singoli target volta all’individuazione di una serie di gruppi funzionali necessari per l’attività inibitoria di HDAC6 e Hsp90. Successivamente, i gruppi funzionali identificati sono stati utilizzati per filtrare una libreria contenente milioni di composti commercialmente disponibili, consentendo la selezione di un insieme di molecole su cui sono poi stati eseguiti degli screening mediante metodologie computazionali. Nello specifico, le molecole filtrate sono state sottoposte a uno screening di similarità ligand-based, utilizzando come query alcuni composti con attività nei confronti di Hsp90 e HDAC6. Inoltre, sono state eseguite una serie di analisi structure-based mediante docking su diverse strutture cristallografiche rappresentative di HDAC6 e Hsp90. L’integrazione di metodologie ligand- e structure-based ha permesso di individuare 19 composti candidati quali potenziali inibitori duali di Hsp90 e HDAC6. I 19 composti candidati sono stati successivamente oggetto di uno screening in vitro volto a valutare l’attività inibitoria nei confronti dell’enzima ricombinante HDAC6. I saggi in vitro sulla proteina Hsp90 sono al momento in fase di completamento. Infine, alcuni composti tra i più promettenti sono stati somministrati a cellule tumorali di prostata per determinare la loro possibile attività anti-proliferativa e quindi il loro potenziale sviluppo come molecole anti-tumorali.
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Abstract
Heat Shock Protein 90 (Hsp90) is an ATP-dependent molecular chaperon whose main physiological function is to maintain the correct folding of proteins in response to cellular stress conditions, thus preventing the accumulation of potentially toxic aggregates into cells. Histone Deacetylase 6 (HDAC6) is a class IIb human HDAC, which is mainly localized in the cellular cytoplasm associated to microtubules; its main function is the deacetylation of the lysine 40 of α-tubulin subunit, thus participating to the regulation of microtubule dynamics. Recent research findings and clinical evidence showed that Hsp90 and HDAC6 are often upregulated and overexpressed in cancerous cells, contributing to tumorigenesis, drug resistance, uncontrolled proliferation and metastasis. Furthermore, it has been reported that Hsp90 and HDAC6 activities are strictly related to each other, and that their simultaneous inhibition could provide benefic and synergistic effects against several types of tumors, including prostate cancer. Based on these premises, the aim of this internship thesis was the identification of Hsp90/HDAC6 dual inhibitors.
To this aim, the analysis of known inhibitors of Hsp90 and HDAC6 allowed us to identify several functional groups necessary for the inhibitory activity towards one of the two proteins.
We used the identified functional groups to filter a library containing millions of commercial compounds, in order to retain those with the structural requirements necessary for the activity on Hsp90 and HDAC6. The filtered compounds were then subjected to a series of ligand-based similarity screenings using a restricted set of known inhibitors as query molecules. Moreover, structure-based calculations, i.e. docking, were also performed for the filtered compounds into representative HDAC6 and Hsp90 conformations.
The combination of ligand- and structure-based methods led to the identification of 19 candidates as potential dual inhibitors of Hsp90 and HDAC6. The selected candidates were also tested in vitro to evaluate their inhibitory activity on HDAC6 recombinant protein. The in vitro tests on the Hsp90 recombinant protein are currently ongoing. Finally, the most promising candidates were also tested for their antiproliferative activity on prostate cancer cell lines.
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