Riassunto analitico
Il compartimento proliferativo degli epiteli di rivestimento è composto da 3 tipi di cloni con capacità rigenerativa differente, analizzata mediante il saggio Colony Forming Efficiency: gli olocloni sono le vere e proprie cellule staminali epiteliali, i paracloni sono le cellule che proliferano in modo transiente (Transient-Amplifying cells) prossime al differenziamento terminale, mentre i merocloni hanno caratteristiche intermedie.
Per avere una buona efficacia clinica in un intervento di terapia cellulare ex-vivo che riguarda l’epitelio corneale, è necessaria una percentuale definita di olocloni nel trapianto. Essi sostengono il rinnovamento cellulare dell’epitelio per tutta la vita. Se il loro numero è ridotto, il tessuto epiteliale non viene mantenuto perché i pochi olocloni presenti vanno incontro ad una rapida conversione clonale, con perdita delle capacità proliferative. Per identificarli sono utilizzati vari marcatori proteici, tra i quali ΔNp63α, che in-vivo marca le cellule staminali dello strato basale del limbus.
La Limbal Stem Cell Deficiency (LSCD) è una condizione patologica, congenita o acquisita, in cui sono assenti le cellule staminali nel limbus. Nella LSCD la rigenerazione dell’epitelio corneale non avviene e ciò porta alla progressiva perdita della superficie corneale e all’opacizzazione del tessuto per la migrazione della congiuntiva con conseguente perdita della vista.
Per trattare la LSCD unilaterale, è stato proposto il trapianto autologo di cellule limbari dell’occhio sano, un allotrapianto delle stesse o un trapianto di cellule limbari autologhe prelevate ed espanse in-vitro su un supporto di fibrina (CLET). Per la risoluzione del deficit bilaterale, nel quale non vi è più un limbus autologo intatto da cui prelevare le cellule staminali, è stata dimostrata l’efficacia del trapianto autologo di cheratinociti di mucosa orale coltivati in-vitro (COMET).
Rimane da dimostrare quale sia il meccanismo biologico correlato all’efficacia: le cellule di mucosa orale riformano il tessuto e lo mantengono a lungo termine, oppure esse stimolano eventuali cellule staminali limbari residue a ricostituire l’epitelio corneale? Non sono processi mutualmente esclusivi, quindi è possibile che contribuiscano entrambi.
L’analisi del trascrittoma per microarray ha evidenziato l’over-espressione del trascritto Pax6 negli olocloni di limbus e congiuntiva rispetto agli olocloni di mucosa orale. Invece, i trascritti Sox2 e Pitx2 sono risultati over-espressi in mucosa orale.
In questo lavoro, abbiamo analizzato l’espressione di Pitx2 a livello di RNA e proteina in questi tre tessuti per dimostrare il suo utilizzo, insieme a Sox2, come marcatore di mucosa orale in trapianti COMET. Ciò permetterà di determinare se il risultato terapeutico sia dovuto, almeno parzialmente, alla ricostruzione corneale da parte del tessuto della mucosa orale, distinguendo i due epiteli.
La linea cellulare HEK293T è stata usata come controllo positivo per l’espressione di Pitx2 e delle sue isoforme (A, B e C). Mediante PCR e qPCR abbiamo osservato che la mucosa orale esprimeva i trascritti di tutte le isoforme di Pitx2, mentre limbus e congiuntiva erano negative. Questi risultati sono stati confermati anche da in situ hybridization (ISH) su sezioni di mucosa e cornea.
PITX2 può essere utilizzato come marcatore della mucosa orale tramite ISH su vetrini di paziente, associato alla presenza del marcatore SOX2.
L’utilizzo di PITX2, insieme a SOX2, consentirà nel follow-up dei pazienti sottoposti a COMET, di capire quali popolazioni cellulari sono presenti e per mettere in luce quale sia il meccanismo biologico alla base della rigenerazione corneale.
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Abstract
The proliferative compartment of the lining epithelia is composed of three types of clones with different regenerative capacities, analyzed by the Colony Forming Efficiency assay: holoclones are the epithelial stem cells, paraclones are the Transient-Amplifying cells close to terminal differentiation , while meroclones have intermediate features.
The holoclones support cellular turnover of the epithelium throughout life. If their number is reduced, the epithelial tissue is not maintained because the few holoclones undergo a rapid clonal conversion. Various protein markers are used to identify them, including ΔNp63α, which in-vivo labels the stem cells of the basal layer of the limbus.
Limbal Stem Cell Deficiency (LSCD) is a pathological condition, congenital or acquired, in which stem cells are absent in the limbus. Therefore, the regeneration of the corneal epithelium does not occur and this leads to the progressive loss of the cornea and the migration of the conjunctiva with consequent opacification of the tissue and loss of vision.
To treat unilateral LSCD, an autologous limbal cell transplant from the healthy eye, an allograft of the same, or a transplant of autologous limbal cells taken and expanded in vitro on a carrier (CLET) can be done. A good clinical efficacy of transplanted epithelium is possible when the percentage of holoclones in the transplant is not less than a specific threshold.
The efficacy of autologous in-vitro cultured oral mucosal keratinocyte (COMET) transplantation has been demonstrated for the resolution of total bilateral deficiency.
The biological mechanism related to efficacy remains to be clarified: oral mucosal cells can regenerate the tissue and maintain it, or do they stimulate any remaining limbal stem cells to rebuild the cornea? These processes are not mutually exclusive, so it is possible that both contribute to clinical outcome.
Analysis of the transcriptome by microarray revealed the over-expression of Pax6 transcript in the limbus and conjunctiva holoclones compared to the oral mucosal holoclones. Instead, Sox2 and Pitx2 transcripts were over-expressed in the oral mucosa.
We analyzed the expression of Pitx2 in these three tissues to demonstrate its use, together with Sox2, as an oral mucosal marker in COMET transplants. This would allow to determine if the therapeutic result is due, at least partially, to the corneal reconstruction by the oral mucosal tissue generated.
The HEK293T cell line was used as a positive control for the expression of Pitx2 and its isoforms (A, B and C). By PCR and qPCR we observed that the oral mucosa expressed transcripts of all Pitx2 isoforms, while limbus and conjunctiva were negative. These results were also confirmed by in situ hybridization (ISH) on sections of mucosa and cornea.
PITX2 can be used as an oral mucosal marker by ISH on patient samples, associated with the presence of the SOX2 marker.
The use of PITX2, together with SOX2, will support the follow-up analysis of patients subjected to COMET to understand which cell populations are present and to highlight the biological mechanism underlying corneal regeneration.
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