Riassunto analitico
L’epidermolisi bollosa distrofica recessiva (RDEB) è una patologia genetica causata da mutazioni nel gene COL7A1, che codifica per il collagene 7, il maggiore componente delle fibrille di ancoraggio localizzate a livello della giunzione dermo-epidermica. Queste mutazioni causano la mancata adesione dell’epidermide al derma, con conseguente fragilità della pelle, gravi lesioni e fibrosi progressiva dei tessuti coinvolti. A livello delle lesioni cutanee infiammate si sviluppa frequentemente un carcinoma squamocellulare, che costituisce la principale causa di morte prematura in questi pazienti. Per questa patologia non si hanno ancora degli specifici trattamenti, per cui risulta di fondamentale importanza sviluppare terapie che permettano una reale cura di questi pazienti. In questo scenario approcci di terapia genica e cellulare rappresentano una strategia promettente per il trattamento di questa patologia. È attualmente in corso un primo trial clinico di fase I/II condotto dal gruppo del Professore Michele De Luca, che prevede l’utilizzo del vettore MLV-γ-retrovirale recante il gene del collagene 7 per la correzione di cheratinociti primari autologhi di pazienti affetti da RDEB. Nonostante questo approccio risulti essere stabile, sicuro e ben tollerato, lo studio clinico ha rivelato una correzione piuttosto limitata delle cellule epiteliali geneticamente modificate trapiantate, con una percentuale di successo del 60% ad un anno di follow-up. I dati raccolti suggeriscono quindi la necessità di aumentare il numero di cellule geneticamente corrette per ottenere un effetto terapeutico elevato. Pertanto, questo studio aveva come obiettivo lo sviluppo di un nuovo vettore SIN-γ-retrovirale e l’analisi della sua efficacia su cheratinociti prelevati da paziente, nell’ottica di una futura applicazione clinica. In particolare abbiamo valutato diversi protocolli di trasduzione, per identificare quello che permettesse di ottenere la più alta efficienza di trasduzione. Per valutare l’effetto tossico (effetto sulla clonogenicità e conversione clonale) del trattamento, i cheratinociti trasdotti e non sono stati tenuti in coltura ed è stata misurata la Colony Forming Efficiency. Inoltre, l’analisi clonale dei cheratinociti trasdotti ha mostrato il mantenimento e la correzione genetica delle cellula staminale, parametri importanti per l’applicazione clinica. I cloni cellulari isolati dall’analisi clonale sono poi stati analizzati per valutare la presenza di riarrangiamenti provirali e, nonostante in un 25% dei casi siano presenti dei provirus riarrangiati, tutti i cloni cellulari geneticamente corretti presentano almeno una copia intera del transgene del collagene 7. L’analisi di RT-PCR quantitativa ha mostrato la stabilità dell’integrazione provirale (VCN/cellula) nelle cellule analizzate. La correzione genica porta ad un estensivo recupero dell’espressione e della sintesi di collagene 7, dimostrato tramite l’analisi di Western Blot. In conclusione, questo studio e i suoi successivi sviluppi pongono le basi per l’utilizzo del vettore retrovirale SIN-γ-COL7A1 come reale trattamento per i pazienti affetti da epidermolisi bollosa distrofica recessiva.
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Abstract
Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa (RDEB) is a genetic disorder caused by loss of function mutations in COL7A1, the gene encoding for type VII collagen, a major component of dermal/epidermal anchoring fibrils. The consequent disruption of the epidermal-dermal junction results in chronic skin fragility, blistering, painful wounds and progressive fibrosis and scarring. Aggressive squamous cell carcinoma frequently develops at wounded, scarred and inflamed sites and represent the main cause of premature death in these patients. The development of long-lasting and curative therapies for RDEB is urgently needed, due to the lack of a specific treatment. Successful clinical outcomes of combined cell and gene therapy clinical trials on severe forms of Junctional EB unveiled potential curative effects, at least for EB skin lesions. However, our early data from a phase I/II gene therapy clinical trial for RDEB pointed to hitherto unsolved issues. The treatment protocol involves the use of MLV-γ-retroviral vector (γRV) carrying COL7A1 and despite this approach appeared safe and well tolerated, it revealed a rather limited restoration of skin lesions, with 60% of success rate at 12 months. Data collected by this clinical trial suggest the necessity to increase the number of gene-corrected stem cells to ensure a high therapeutic effect. Thus, this thesis aimed to develop a new SIN-γRV and to test its efficacy on RDEB keratinocytes. We evaluated different transduction protocols, which would allow the best transduction efficiency in patient’s primary keratinocytes. Untransduced and transduced keratinocytes were maintained in long-term culture and the Colony Forming Efficiency was measured to evaluate cell toxicity (loss of clonogenicity and clonal conversion) during serial cultivation. Clonal analysis was performed on transduced keratinocyte demonstrating the maintenance and gene-correction of stem cells (holoclones), an important parameter for its clinical application. Proviral rearrangements were analyzed on cell clones and, although in few cases rearranged proviruses were detected, normal full-length collagen 7 was expressed by all the gene-corrected keratinocytes. Moreover, relative quantitative RT-PCR analysis showed stable provirus integration (an average of 3 proviral integrations/cell) in the treated cells. The final result is a full restoration of type 7 collagen expression, demonstrated by Western Blot analysis. In conclusion, this study and its future advances pave the way for the use of SIN-γRV for a successful combined cell and gene therapy for RDEB patients.
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