Riassunto analitico
La proteomica basata sulla spettrometria di massa consente di misurare quantitativamente l'attività delle proteine bersaglio e la loro modulazione in contesti diversi, come i fenotipi delle malattie o la risposta ai trattamenti farmacologici contro bersagli biologici; il suo ruolo è quindi fondamentale nella fase preclinica dello sviluppo di nuovi farmaci. L'approccio più utilizzato nella proteomica shotgun è l'analisi Label-free. Tuttavia, alcuni limiti legati a questo metodo sono stati superati da un'altra strategia di proteomica quantitativa Labeled, che consente l'analisi di diverse condizioni di campione in un'unica corsa LC-MS/MS. In questo contesto, il TMT consiste nella derivatizzazione dell'N terminale di peptidi digeriti con marcatori isobarici, che vengono idrolizzati in ioni segnale durante la frammentazione ms/ms e possono essere quantificati per fornire abbondanze peptidiche complessive in modo più accurato rispetto a un esperimento MS Label-Free. La quantificazione delle proteine, così come la loro identificazione, è essenziale per guidare la ricerca farmaceutica contro le proteine bersaglio che sono rilevanti nella progressione del cancro e nella chemioresistenza. La timidilato sintasi umana (hTS) è un enzima nucleare responsabile dell'unica fonte de novo di timidilato nella cellula, in quanto catalizza la metilazione di dUMP in dTMP, utilizzando MTHF come cofattore dal ciclo dei folati. hTS ha diverse conformazioni e stati, ma solo la forma dimerica è responsabile dell'attività catalitica. Per il suo ruolo nella sintesi dei nucleotidi e nella progressione del ciclo cellulare, è un bersaglio farmacologico convalidato da oltre 70 anni. In effetti, i suoi livelli di espressione e la sua attività sono più elevati in alcuni tumori solidi, tra cui il cancro del colon-retto (CRC). Il trattamento di prima linea per i pazienti affetti da CRC si basa sul regime di 5-fluorouracile, un inibitore hTS il cui legame impedisce la replicazione del DNA. Tuttavia, una grande percentuale di pazienti diventa resistente dopo lunghi trattamenti. I meccanismi più importanti che contribuiscono alla chemioresistenza al 5-FU sono legati a molte pathway, tra cui PI3K/AKT, Wnt/β-catenina e la regolazione di hTS. In effetti, la overespressione della timidilato sintasi, o la sua attività upregolata, è correlata alla resistenza e a uno scarso esito terapeutico. Per superare il problema della resistenza associata agli inibitori classici della timidilato sintasi (falsi nucleotidi o antifolati), il Laboratorio di Drug Discovery and Biotechnology (UNIMoRe) ha sviluppato nuovi inibitori allosterici, ovvero i dimer-destabilizers (DDIs), che hanno come bersaglio l'interfaccia tra i due monomeri e inducono la rottura del dimero e la degradazione proteosomale dell'hTS. E7, il composto principale dei DDIs, ha dimostrato di inibire l'attività e l'espressione di hTS sia in vitro che in vivo e di ritardare l'insorgenza della chemioresistenza indotta dal 5-FU.
Lo scopo di questo progetto è di studiare la modulazione del proteoma indotta dall'E7 in combinazione con il 5-FU, al fine di valutare le basi biochimiche per oltrepassare il problema della chemioresistenza nelle linee cellulari di cancro colorettale quando vengono somministrati in sinergia. Questo studio è un’analisi di proteomica quantitativa MS labeled TMT, organizzata come segue:
i. Induzione della resistenza al 5-FU nella linea cellulare HCT-116;
ii. Valutazione di tre condizioni di trattamento: 5-FU, E7 in combinazione con 5-FU e solvente (DMSO);
iii. Proteomica MS labeled TMT, ossia protocollo di digestione in soluzione, estrazione SPE e labeling con kit TMT 6-plex;
iv. Analisi dei risultati MS con Proteome Discoverer e Mascot Matrix, per identificare le proteine espresse in modo differenziale (DEP);
v. Analisi delle DEP con strumenti bioinformatici (Reactome, STRING).
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Abstract
Mass Spectrometry-based proteomics provides quantitative measurement of target proteins activity and their modulation in different contexts, such as disease phenotypes or in response to drug treatments against biological targets, hence its role is pivotal in the preclinical phase of the Drug Discovery process. The most employed approach in shotgun quantitative proteomics is Label-free analysis. However, some limitations related to this method are overcome by another quantitative proteomics which is Labeled, that allows the analysis of several sample conditions together in a single LC-MS/MS run. In this context, TMT-tagging consists in the N-derivatization of the digested peptides with isobaric markers, which are hydrolyzed into reporting ions during ms/ms fragmentation, and can be quantified to give overall peptide abundances in a more accurate way than in a MS Label-Free experiment.
Quantification of proteins, as well as their identification, is essential to drive Pharmaceutical research against target proteins which are relevant in cancer progression and chemoresistance. Human Thymidylate Synthase (hTS) is a nuclear enzyme responsible for the only de novo source of thymidylate in the cell, as it catalyzes methylation of dUMP to dTMP, using mTHF as cofactor from the Folate Cycle. hTS has different conformations and states, but only the dimeric form is responsible for the catalytic activity. Due to its role in nucleotide synthesis and cell cycle progression, it has been a validated drug target for over 70 years. Indeed, its expression levels and activity are higher in some solid tumors, including in colorectal cancer (CRC). First line treatment for CRC patients has been based on 5-Fluorouracil regimen, a hTS inhibitor whose binding prevents DNA replication. However, a large percentage of patients becomes resistant after long treatments. Most relevant mechanisms, which contribute to chemoresistance to 5-FU, are related to many signaling, including PI3K/AKT, Wnt/β-catenin signaling pathways as well as the regulation of hTS. In fact, overexpression of thymidylate synthase, or its upregulated activity, is related to resistance and a poor therapeutic outcome. In order to overcome the resistance issue associated with classical thymidylate synthase inhibitors (either false nucleotides or antifolates), the Drug Discovery and Biotechnology Laboratory (UNIMoRe), has developed new allosteric inhibitors, namely dimer-destabilizers (DDIs), which target the interface between the two monomers, and inducting dimer disruption into monomers and hTS proteasomal degradation. E7, which is the lead compound of the DDIs, was demonstrated to inhibit hTS activity and expression both in vitro and in vivo, and to delay the onset of 5-FU induced chemoresistance.
The aim of this project is to investigate proteome modulation induced by E7 in combination with 5-FU, in order to evaluate the biochemical bases of the delayed drug resistance in colorectal cancer cell lines when they are administered synergistically. This study was a TMT-labeled MS quantitative Proteomics, organized as follows:
i. Induction to 5-FU resistance in HCT-116 cell line;
ii. Assessment of three treatment conditions: 5-FU, E7 in combination with 5-FU, and vehicle (DMSO);
iii. TMT-labelled MS Proteomics, i.e., typical in solution digestion protocol, SPE-extraction and 6-plex TMT kit labeling;
iv. Analysis of MS results in Proteome Discoverer and Mascot Matrix suite, to identify differential expressed proteins (DEPs);
v. DEPs analysis with bioinformatic tools (Reactome, STRING).
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