Riassunto analitico
La Direttiva europea 2010/63/EU si basa sul Principio delle tre R (reduce, refine e replace), enunciato per la prima volta nel 1959 dagli scienziati Russel e Burch. Obiettivo della Direttiva è quello di implementare l’utilizzo di modelli alternativi ai vertebrati, migliorando le condizioni degli animali da laboratorio e, contemporaneamente, aumentare la qualità degli studi scientifici. Lo stesso principio è stato poi mantenuto nel decreto legislativo italiano n. 26 del 2014, che si applica ad animali vertebrati non umani, comprese forme larvali capaci di autoalimentarsi, forme fetali di mammifero a partire dall’ultimo terzo del loro normale sviluppo e, unici tra gli invertebrati, ai cefalopodi vivi. Questa nuova prospettiva nell’affrontare la sperimentazione animale ha spinto molti gruppi a cercare dei modelli di invertebrato non menzionati dalla legge in vigore, ma che avessero gli attributi necessari per poter essere considerati alternativi/complementari ai modelli di vertebrato più utilizzati. Pomacea canaliculata è un mollusco gasteropode, facile da allevare, manipolare e presenta dimensioni e longevità simili ai topi, i modelli più utilizzati nella ricerca scientifica, inclusa la sperimentazione sui nanofarmaci. Nella mia tesi, sono state testate due diverse preparazioni (TCD1 e TCD2) di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIONs), che attualmente rappresentano un potenziale strumento teranostico in ambito anti-neoplastico. Questo progetto è derivato da una collaborazione con il Laboratorio di Caratterizzazione Biologica dei Materiali Avanzati (LBCAM) del Trinity College di Dublino, che ha progettato le SPIONs. Il mio protocollo ricalca quello usato su topi e ratti al LBCAM. L'obiettivo principale era quello di valutare la mortalità entro le 24 ore dall’iniezione nel piede della chiocciola, di 5 dosi crescenti dei due preparati; il secondo era quello valutare la risposta tissutale e l'eventuale accumulo di TCD1 e 2 negli organi selezionati (cuore, rene anteriore, rene posteriore e ghiandola digestiva). Per tutti i trattamenti, la mortalità del trattamento è stata nulla. Pertanto, dopo 24 ore di incubazione, tutti gli animali sono stati anestetizzati e dissezionati microchirurgicamente per la raccolta degli organi. Gli organi selezionati sono stati fissati, disidratati e inclusi in paraffina. I preparati istologici sono stati allestiti con fette seriate e i vetrini recanti sezioni adiacenti sono stati colorati morfologicamente con ematossilina-eosina (HE) oppure istochimicamente con colorazione di Perls, che colora di blu cobalto il ferro presente nei tessuti. Le immagini dei preparati sono state raccolte al microscopio, e l’accumulo di SPION è stato determinato semi-quantitativamente mediante uno specifico plugin in Matlab®. Con l'utilizzo di questo metodo semi-quantitativo è possibile quantificare la presenza di SPIONs in migliaia di immagini attraverso la valutazione del numero e della percentuale di pixel blu cobalto. I valori numerici ottenuti hanno permesso l’analisi statistica dei risultati dimostrando che:
-l'iniezione di SPIONs non provoca mortalità;
-l'accumulo di SPIONs è organo, dose e trattamento-specifico.
In assenza di marker di infiammazione specie-specifici rilevabili per via immunoistochimica, l'osservazione dei preparati colorati con HE non mostra alterazioni significative rispetto agli animali di controllo non iniettati o vehicle-injected.
Nel complesso, inserendosi nel contesto della normativa vigente, la mia tesi fornisce il protocollo e la prova preliminare a sostegno dell'adozione di P. canaliculata come possibile alternativa ai modelli in vivo di roditori negli studi preliminari sul bioaccumulo e sulla biosicurezza di farmaci e prodotti a base di nanoparticelle.
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