Riassunto analitico
Il sistema immunitario degli invertebrati si basa sulla sola immunità innata (II), data dall’attività integrata delle componenti cellulare ed umorale. La prima è costituita prevalentemente da cellule circolanti nell’emolinfa definite emociti. Nonostante le numerose ricerche sugli emociti in svariati modelli di invertebrato rimangono molti interrogativi circa il loro sviluppo e la loro maturazione. Per rispondere a questi interrogativi, l’identificazione di marker emocitari (ME) che consentano il riconoscimento di popolazioni emocitarie circolanti o tissutali, sarebbe prezioso. Pomacea canaliculata (Pc), gasteropode di acqua dolce, si sta affermando come modello di studio in ambito immunobiologico, anche grazie alla disponibilità di genoma, trascrittomi e proteomi tessuto-specifici. Le crescenti informazioni a disposizione e la possibilità di ottenere notevoli quantità di emolinfa senza sacrificare l’animale, qualificano Pc come un candidato ideale per l’individuazione di ME tra i molluschi. Questo progetto di tesi ha dunque lo scopo di identificare dei ME che consentano di individuare eventuali sottopopolazioni di emociti circolanti nell’emolinfa, in tessuti considerati ematopoietici e in processi come la rigenerazione del tentacolo cefalico. La ricerca di ME ha previsto una prima fase di analisi in silico al fine di individuare delle sequenze conservate nei metazoi. Queste sono poi state ulteriormente selezionate in base ai valori di RPKM nei trascrittomi tessuto-specifici di emolinfa, fluido pericardico e rene posteriore. Sono così state selezionate Hc, TG-ase2, AIF1, RUNT e Hhex. L’espressione delle molecole è stata valutata negli emociti circolanti con FISH a singola sonda per stabilire la percentuale di cellule positive ai singoli ME. Tutti i potenziali ME sono espressi negli emociti circolanti, e la maggiore percentuale di cellule positive è stata rilevata per Hc. FISH con doppia sonda è stata impiegata per valutare la co-espressione dei ME negli emociti circolanti, e comprendere se esistano pattern di espressione. Ciò ha permesso di osservare sia co-localizzazione che localizzazione disgiunta per ogni combinazione di ME, confermando la complessità degli emociti e la necessità di una caratterizzazione anche funzionale e non solo morfologica per queste cellule. Una volta stabilite le molecole considerabili come ME negli emociti circolanti, sempre mediante FISH si è valutato se le stesse consentissero di individuare anche gli emociti distribuiti in organi complessi. Per questo sono stati sottoposti a FISH su fetta il rene posteriore ed il tentacolo cefalico di controllo (TC-0 hpa) od in fase rigenerazione, 12 ore dopo l’amputazione (TR-12 hpa). Le FISH su fetta hanno dato un importante riscontro positivo, consentendo di individuare in modo specifico gli emociti tissutali anche in organi complessi. Inoltre, le osservazioni microscopiche hanno suggerito l’aumento degli emociti nel TR-12 hpa, Pertanto, al fine di integrare il dato morfologico con una quantificazione accurata dei ME, l’espressione degli stessi è stata quantificata mediante RT-qPCR in campioni TC-0 hpa e TR-12 hpa. Gli esperimenti di qRT-PCR hanno confermato l’espressione di tutti i ME in analisi. Inoltre, Hc, TG-ase2 e RUNT risultano significativamente indotti nei campioni TR-12 hpa. L’applicazione combinata di diverse tecniche ha permesso di identificare per la prima volta dei ME in grado di marcare sia gli emociti circolanti che gli emociti tissutali in Pc. In questo senso, Hc sembra essere il ME più promettente per individuare anche singoli emociti in matrici tissutali complesse. L’inedita possibilità di riconoscere specificamente gli emociti a livello tissutale con ME apre nuove e significative prospettive nello studio dell’II in modelli di invertebrato.
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