• endocannabinoide
• osteoblasti
• osteogenesi
• rimodellamento osseo
• sostanze psicoattive

I cannabinoidi sintetici (SC) sono un nuovo gruppo di sostanze psicoattive (NPS) che legano e attivano i recettori dei cannabinoidi (CBR), ovvero CB1 e CB2, con maggiore potenza rispetto al tetraidrocannabinolo (THC), il principale elemento psicoattivo della cannabis. Il loro crescente abuso è diventato una dei principali fenomeni di interesse per la salute pubblica, poiché sono stati segnalati diversi casi di avvelenamenti e morti legati ai SC. Queste sostanze modulano il sistema endocannabinoide che, a sua volta, è coinvolto nella regolazione di diversi processi biologici, tra cui il rimodellamento osseo. In questo studio, abbiamo ipotizzato che i SC possano interferire con il rimodellamento osseo, in particolare con l'osteogenesi. Per affrontare questa ipotesi, abbiamo valutato gli effetti di due SC comunemente riscontrati nei sequestri di sostanze d’abuso all'interno dell'Unione Europea - XLR-11 e ADB-FUBINACA - sull'osteogenesi in vitro e il coinvolgimento dei CBR nella modulazione mediata dai SC dell'osteogenesi.
I pre-osteoblasti di topo MC3T3-E1 sono stati differenziati in osteoblasti in presenza di acido ascorbico alla concentrazione di 50 µM e di glicerofosfato a 20 mM. Gli effetti dei SC sul differenziamento cellulare sono stati determinati esponendo le cellule MC3T3-E1 a XLR-11 o ADB-FUBINACA a concentrazioni biologicamente rilevanti (1 nM e 1 μM). I SC sono stati aggiunti all'inizio del differenziamento (t0) e ogni 3 giorni fino a 21 giorni. Sono stati testati anche il controllo-veicolo (0,1% DMSO) e un controllo positivo (300 μM naprossene). L'attività della fosfatasi alcalina (ALP) è stata misurata dopo 7, 10 e 14 giorni attraverso un saggio colorimetrico, mentre la deposizione di calcio extracellulare attraverso la colorazione con rosso di alizarina. Il coinvolgimento dei CBR nell'azione mediata dai SC è stato accertato pre-incubando le cellule con specifici agonisti inversi (500nm SR141716 e 500nm SR144258, rispettivamente per CB1 e CB2) 20 minuti prima dell'aggiunta dei SC. Inoltre, l'espressione di RUNX2, una proteina chiave nel differenziamento degli osteoblasti, è stata valutata facendo uso della Western-blot.
I risultati hanno mostrato che entrambi i SC testati hanno aumentato l'attività di ALP dopo 10 e 14 giorni dall’inizio dell’esposizione. In particolare, 1 μM XLR-11 ha aumentato significativamente l'attività di questo enzima di circa 2 volte il giorno 10 e circa 1,5 volte il giorno 14, rispetto al veicolo. Entrambe le concentrazioni di ADB-FUBINACA testate (1 nM e 1 μM) hanno aumentato l'attività di ALP il giorno 10 rispettivamente di circa 2,5 e 2 volte, mentre al giorno 14 solo le cellule trattate con 1 nM di ADB-FUBINACA hanno mostrato un aumento dell'attività di ALP (circa 1,5 volte). Tuttavia, nessuno dei CBR principali (CB1 e CB2) sembra mediare questi cambiamenti nell'attività di ALP, poiché la pre-incubazione delle cellule con SR141716 e SR144258 non ha alterato i livelli di attività di ALP in presenza dei SC. Inoltre, non sono state osservate differenze statisticamente significative nella deposizione di calcio o nell'espressione di RUNX2 nelle cellule esposte ai SC rispetto al controllo-veicolo. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per permettere di chiarire i meccanismi molecolari alla base degli effetti dei SC sul differenziamento osteoblastico e per capire meglio come queste sostanze interferiscono con l'osteogenesi.

Synthetic cannabinoids (SCs) are a diverse group of new psychoactive substances (NPSs) that bind and activate cannabinoid receptors (CBRs), namely CB1 and CB2, with higher potency than tetrahydrocannabinol (THC), the main psychoactive element of cannabis. Their increasing abuse has become a major public health concern, as several cases of SC-related poisonings and deaths have been reported. These substances modulate the endocannabinoid system, which in turn is involved in the regulation of several biological processes, including bone remodeling. Here, we hypothesized that SCs may interfere with bone remodeling, in particular with osteogenesis. To address this hypothesis, we evaluated the effects of two SC commonly found in seizures within the European Union – XLR-11 and ADB-FUBINACA - on in vitro osteogenesis and the involvement of CBRs in SC-mediated modulation of osteogenesis. MC3T3-E1 mouse pre-osteoblasts were differentiated into osteoblasts in the presence of 50 µM ascorbic acid and 20mM β-glycerophosphate. The effects of the SCs on osteoblast differentiation were determined by exposing MC3T3-E1 cells to either XLR-11 or ADB-FUBINACA at biologically-relevant concentrations (1 nM and 1 μM). SCs were added at the beginning of the differentiation (t0) and every 3 days up to 21 days. A vehicle (0.1% DMSO) and positive (300 μM naproxen) were also tested. Alkaline phosphatase (ALP) activity was then measured after 7, 10, and 14 days using a colorimetric assay, and calcium deposition was analyzed on days 14 and 21 by Alizarin Red staining. The involvement of CBRs in the SCs-mediated action was ascertained by pre-incubating the cells with specific CBR inverse agonists (500nM SR141716 and 500nM SR144258, for CB1 and CB2, respectively) 20 min prior to the addition of the SCs. Moreover, the expression of RUNX2, a key protein involved in osteoblast differentiation, was assessed using Western-blot. The results showed that both SCs tested increased ALP activity following 10 and 14 days of exposure. In particular, 1 μM XLR-11 significantly increased the activity of this enzyme by about 2-fold on day 10 and about 1.5-fold on day 14, compared to the vehicle. Both ADB-FUBINACA concentrations tested (1 nM and 1 μM) increased ALP activity on day 10 by about 2.5- and 2-fold, respectively, while at day 14 only cells treated with 1 nM ADB-FUBINACA showed an increase in ALP activity (about 1.5-fold). However, none of the main CBRs (CB1 and CB2) seemed to mediate these changes in ALP activity, since the cells’ pre-incubation with SR141716 and SR144258 did not alter the levels of ALP activity in the presence of the SCs. Notably, no statistically significant differences were observed in calcium deposition or RUNX2 expression in the SC-exposed cells, compared to the vehicle control As such, further research is required to help elucidate the molecular mechanisms underlying the effects of SCs on osteoblast differentiation, and to better understand how these substances interfere with osteogenesis.