Riassunto analitico
L’epcidina, codificata dal gene HAMP, è un ormone peptidico prodotto prevalentemente a livello epatico e svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo del ferro, in quanto è in grado di legare e indurre la degradazione della ferroportina, l’unico esportatore cellulare di ferro ad oggi noto nei mammiferi. L’epcidina agisce principalmente a livello intestinale e dei macrofagi del sistema reticoloendoteliale, dove blocca rispettivamente l'assorbimento del ferro dalla dieta e il rilascio del metallo ottenuto dalla eritrofagocitosi, con conseguente riduzione della disponibilità di ferro a livello ematico. Dato il meccanismo di azione dell’epcidina, risulta evidente come una deregolazione nella sua espressione possa essere associata a patologie da sovraccarico o carenza di ferro.
La maggior parte degli stimoli regolatori che notoriamente influenzano la produzione di epcidina, come la quantità di ferro presente nell’organismo, l’eritropoiesi e l’infiammazione, si intersecano con la via di segnalazione BMP/SMAD, delineando questa via come uno dei più importanti regolatori della trascrizione del gene HAMP. Il legame delle BMP ai loro recettori può avvenire sia in corrispondenza delle CCP (Clathrin-Coated Pits) che delle caveolae e, in base al sito di inizio della trasduzione del segnale, viene attivata rispettivamente la via SMAD-dipendente oppure quella SMAD-indipendente. Ad oggi alcune evidenze sperimentali hanno messo in discussione questo modello, sottolineando la possibilità che le caveolae possano essere coinvolte anche nella via SMAD-dipendente. I risultati contrastanti sono stati ottenuti da sperimentazioni su tipi cellulari differenti, suggerendo che proprio il contesto cellulare possa essere determinante nel definire il tipo di risposta cellulare.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di indagare nella linea di epatoma umano, Hep3B, il ruolo di clatrina (CLTC) e caveolina 1 (CAV1) nella via BMP/SMAD, con il fine ultimo di comprendere il loro contributo nella regolazione trascrizionale del gene HAMP. In particolare, è stato indagato il ruolo di caveolina 1 nella modulazione della via BMP/SMAD e la sua correlazione con i diversi tipi di SMAD (SMAD1, SMAD5) coinvolti nell’espressione di epcidina.
A tal fine, le cellule Hep3B sono state silenziate in modo transiente per CLTC o CAV1 e questo approccio è stato poi combinato alla mutagenesi del promotore di HAMP in corrispondenza del sito di risposta alle BMP (BRE). Nelle cellule deprivate di CLTC, che mostrano un’attivazione compensatoria della via caveolae-dipendente, si riscontra un inaspettato aumento della fosforilazione delle SMAD associato ad up-regolazione del gene HAMP, condizione che viene meno mutando il promotore in corrispondenza del BRE. Nelle cellule deprivate di CAV1 si riscontra un’aumentata fosforilazione delle SMAD che però, al contrario di quanto atteso, si associa a una marcata down-regolazione del gene HAMP. Questi esperimenti hanno evidenziato come la regolazione di epcidina attraverso i fattori trascrizionali SMAD coinvolga CAV1. In seguito, per indagare la correlazione di CAV1 con i diversi tipi di SMAD (SMAD1, SMAD5), abbiamo valutato l’espressione di epcidina in cellule Hep3B deprivate contemporaneamente di CLTC e SMAD1 o SMAD5. Questo approccio ha evidenziato come la regolazione di epcidina coinvolga prevalentemente SMAD5, dato che la presenza di questo fattore di trascrizione risulta indispensabile al fine di ricapitolare l’incremento della trascrizione del gene HAMP indotto dall’assenza di CLTC.
Grazie a questo lavoro abbiamo dimostrato come la regolazione dell’espressione di epcidina attraverso la via BMP/SMAD, coinvolga e richieda CAV1 e questa esplichi la sua influenza prevalentemente tramite SMAD5.
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