Riassunto analitico
Nel secolo scorso gli antibiotici sono stati in grado di migliorare in modo sorprendente la durata e la qualità della vita degli esseri umani ma attualmente non sono più in grado di garantire tale condizione di benessere a causa del loro uso eccessivo ed inappropriato che ha ampiamente favorito lo sviluppo di batteri multi resistenti.
La risoluzione del fenomeno dell’antibiotico resistenza richiede interventi sia nella sfera socioeconomica sia in ambito scientifico. I laboratori di ricerca sia accademici che industriali si sono concentrati principalmente sull’identificazione di target batterici più selettivi ma anche più facilmente accessibili in modo tale da garantire lo sviluppo di nuove molecole in grado di contrastare con meccanismi d’azione innovativi i batteri multi resistenti.
La mia tesi sperimentale di laurea in Farmacia, svoltasi presso la School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences della Cardiff University all’interno del programma Erasmus+, si colloca nell’ambito di un progetto relativo alla sintesi e sviluppo di inibitori dell’enzima acido lipoteicoico sintasi (LtaS) come nuovi potenziali agenti per l’antibiotico terapia.
Gli acidi lipoteicoici (LTAs) sono polimeri di alcoli polivalenti interconnessi grazie a gruppi fosfato ed associati alla membrana plasmatica dei batteri gram-positivi per mezzo dell’ancora lipidica gentobiosil-diacilglicerolo. Tali polimeri risultano essenziali sia per la sopravvivenza che per la patogenicità dei batteri gram positivi e l’enzima LtaS, assente negli esseri umani e vantaggiosamente esposto all’ambiente extracellulare, rappresenta un valido target per inibirne la crescita e la formazione del biofilm.
Il composto 1771, un derivato 1,3,4-ossadiazolico, selezionato da Stefan G. Richter e coll. mediante screening di una libreria di piccole molecole contro batteri gram-positivi, è risultato in grado di legarsi efficacemente nel sito attivo della LtaS impedendo l’accesso al substrato naturale glicerofosfato. In letteratura ad oggi non è stata riportata nessuna via sintetica per questo composto.
La prima parte del lavoro di tesi si è quindi concentrata sulla sintesi del composto 1771: è stato elaborato un approccio retrosintetico in 7 steps, e dopo ottimizzazione delle condizioni di reazione per ogni passaggio, è stato ottenuto il prodotto desiderato sufficientemente puro e in quantità adeguata per poterlo sottoporre a test microbiologici su ceppi di S. aureus, C. difficile e sui loro rispettivi modelli di biofilm.
La stessa procedura sintetica è stata in seguito applicata alla sintesi di due analoghi ottenuti sostituendo, nel primo passaggio sintetico, in un caso la benzaldeide con l’analogo 4-trifluorometil-sostituito e nell’altro utilizzando l’-naftolo al posto del -naftolo.
Durante l’ultimo step sintetico, oltre agli attesi derivati di O-acilazione è stata osservata la formazione dei prodotti di doppia acilazione (O, N-diacilati). Ognuno di questi prodotti è stato isolato, caratterizzato e sarà sottoposto a screening microbiologico.
Il composto 1771, così come i due analoghi di nuova sintesi, sono risultati instabili in soluzioni di metanolo, dimetilsolfossido e cloroformio a temperatura ambiente.
Pertanto prima di procedere ad uno studio SAR mediante la sintesi di una libreria di analoghi sono stati condotti test di stabilità qualitativi e quantitativi mediante l’uso di tecniche quali HPLC e NMR.
Una volta individuate le possibili vie di degradazione abbiamo proposto a livello teorico possibili soluzioni al problema, per il disegno di molecole più stabili, che abbiano di conseguenza un maggior potenziale per essere sviluppate come farmaci.
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Abstract
In the past antibiotics have improved the quality of life becoming essential in the health system worldwide, now these drugs are not effective to support this well-being anymore. The inappropriate and excessive use of antibiotics has led to the rise of drug-resistant microorganisms.
Antibiotic resistance is an important and complex issue involving several aspects of social, scientific and economic life of human beings.
Academia and, in general, research laboratories are focusing their study mainly on the identification of more selective and accessible bacterial targets and at the same time on the development of new molecules able to defeat multi-resistant bacteria with novel mechanisms of action.
My experimental thesis, developed under a Erasmus+ program at the School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences of Cardiff University, is a part of a research project aimed at identifying Lipoteichoic Acid Synthase (LtaS) Inhibitors as Potential Agents for Antibiotic Therapy.
The lipoteichoic acids, polymers of polyvalent alcohols interconnected by phosphate groups and associated with the plasma membrane of gram-positive bacteria by the lipidic anchor gentobiosyl-diacylglycerol, are important both in the survival and in the pathogenicity of gram positive bacteria. LtaS, an enzyme lacking in humans and easy accessible because exposed to extracellular environment bacteria, was selected as a valid target to inhibit bacterial both growth and biofilm formation.
Compound 1771, reported by Stefan G. Richter as able to effectively bind the active site of the LtaS preventing its access to the natural glycerol phosphate substrate, was identified as a lead compound. So far careful screening of the literature did not return any synthetic procedure for this compound.
Seeking to develop the synthesis of compound 1771 we have first elaborated a retrosynthetic approach based on 7 steps. Then following this synthetic scheme we have carried out several experiments in order to find the optimal reaction conditions for each step and finally we were able to obtain the desired product sufficiently pure and in significant amount for microbiological tests on strains of S. aureus and C. difficile and their respective biofilm models.
The same synthetic procedure was then applied to obtain two analogues by replacing in the first synthetic step the unsubstituted benzaldehyde with the 4-trifluoromethyl analog in one case and by using alpha- instead of beta-naphthol in the other.
During the last synthetic step, in addition to the expected O-acylation derivatives, the formation of dual acylation products (O, N-diacylates) was observed. Each of these products has been isolated, characterized and they will be subjected to microbiological screening.
Compound 1771, as well as the two new analogs, are unstable in methanol, dimethyl sulfoxide and chloroform solutions at room temperature. Therefore, before carrying out a SAR study by synthesizing a library of analogues, qualitative and quantitative stability tests were performed by HPLC and NMR.
Once the possible degradation pathways were identified, we had been able to suggest possible solutions to this problem, for the design of more stable molecules, which consequently will have a greater potential to be developed as drugs.
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