Riassunto analitico
Nonostante le recenti innovazioni nelle tecnologie OMICHE, la scoperta e lo sviluppo di nuovi farmaci rimangono dei processi lunghi e costosi. L'emergere della spettrometria di massa come nuova strategia per il sequenziamento dei peptidi ha giocato un ruolo chiave nel rapido progresso della proteomica MS bottom-up. Tale metodo, associato allo sviluppo di nuovi strumenti bioinformatici, ha consentito il progresso di nuove strategie di drug profiling, che permette di caratterizzare il meccanismo d'azione di un farmaco a livello cellulare/subcellulare. La timidilato sintasi umana è un bersaglio validato per la terapia antitumorale poiché è implicata nella sopravvivenza delle cellule. hTS è un enzima omodimerico obbligato, presente in diversi stati e conformazioni ma solo il suo conformero attivo partecipa al ciclo dei folati catalizzando la metilazione de novo del dUMP in dTMP, utilizzando il cofattore mTHF come donatore di gruppi metilenici. Oltre alla sua funzione catalitica, hTS regola la sintesi proteica agendo sul proprio trascritto attraverso un meccanismo di feedback negativo, ed è anche in grado di legare trascritti di geni implicati nella regolazione dei meccanismi di apoptosi. Gli inibitori classici di hTS nel CRC portano a un meccanismo di sovraespressione dell'enzima, con conseguente resistenza ai farmaci Pemetrexed, 5FU altri farmaci chemioterapici. Per questo motivo, il Laboratorio di Drug Discovery and Biotechnology (UniMoRe) ha sviluppato nuovi inibitori i Dimer Destabilizer (DDI) che superano il problema della resistenza ponendosi all'interfaccia trai i due monomeri attraverso un legame non covalente. È stato dimostrato che la somministrazione di questi DDI aumenta la degradazione dell'enzima a livello del proteasoma e mantiene l'attività di autoregolazione trascrizionale. Tuttavia, nonostante il bersaglio e il suo meccanismo inibitorio siano già stati chiariti, l'assetto biochimico delle cellule bersaglio e la regolazione della risposta al danno al DNA rimangono poco chiari. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è la caratterizzazione del meccanismo d'azione del composto E7, leader delle DDI, e il suo confronto con quello del 5-fluorouracile, un pro-farmaco chemioterapico comunemente usato in clinica. In particolare, lo studio si propone di:
i. Identificare le vie biochimiche coinvolte nel meccanismo d'azione dell'E7;
ii. Esaminare come questo meccanismo si evolve nel tempo analizzando i cambiamenti di espressione proteica a 6 e 12 ore dalla somministrazione del farmaco;
iii. Confrontare il meccanismo d'azione dell'E7 con quello del 5FU, con particolare attenzione al ruolo dei farmaci anti-hts nella regolazione della risposta delle cellule tumorali e fornendo approfondimenti sui meccanismi molecolari coinvolti.
iv. Identificare possibili effetti off-target indotti dal trattamento con DDis.
Le colture di cellule CRC sono state trattate con il composto E7 e un pro-farmaco chemioterapico, il 5FU. Le proteine estratte sono state processate con il protocollo Filter-Aided Sample Preparation e analizzate con la tecnica di spettrometria di massa quantitativa label free. I risultati della MS sono stati analizzati quantitativamente con il software PEAKS per identificare le proteine differenzialmente espresse, che sono state sottoposte a un'ulteriore esplorazione bioinformatica con diversi software. La generazione di network arricchiti ha permesso di identificare e clusterizzare i principali percorsi biochimici e funzionali coinvolti nella risposta ai farmaci. I metadati sono stati integrati con i risultati di un'analisi molecolare eseguita sugli stessi campioni, che ha evidenziato l'up-regolazione di biomarcatori di danno al DNA. Sulla base di queste premesse, abbiamo identificato un pannello di proteine che sarà validato tramite saggi funzionali.
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Abstract
Despite recent innovations in OMIC technologies, drug discovery and development remain a long and expensive process. The emergence of Mass Spectrometry (MS) as a new strategy for peptide sequencing, have played a key role in the rapid advancement of bottom-up MS proteomics. Such method, associated with the development of new bioinformatic tools, have enabled the progress of new strategies for global drug profiling, which allows us to characterize the mechanism of action of a drug at the cellular/subcellular level. Human Thymidylate Synthase (hTS) has been a validated target for anti-tumor therapy for over 70 years, as it is implicated in cell survival. hTS is a highly conserved, obligate homodimeric enzyme present in several different states and conformations: monomer/dimer and active/inactive. Only its active conformer participates in the folate cycle by catalyzing the de novo methylation of dUMP into dTMP, employing the cofactor mTHF as a methylene group donor. In addition to its catalytic function, hTS regulates protein synthesis by acting on its own transcript- probably in its monomeric conformer- through a negative feedback mechanism, and is also able to bind gene transcripts implicated in the regulation of apoptosis mechanisms. hTS classical orthosteric inhibitors in CRC and ovarian cancer lead to a mechanism of over expression of the enzyme, leading to drug resistance against Pemetrexed, 5FU and cross-resistance with other chemotherapeutic drugs like platinum-derived. This poses the need to develop new drugs to avoid drug resistance. For this reason, the Drug Discovery and Biotechnology Laboratory (UniMoRe) has developed new Dimer Destabilizers (DDIs) that overcome the drug resistance issue by targeting the interface between the two monomers through noncovalent binding. Administration of these DDIs was demonstrated to increase proteasomal degradation of the enzyme and maintain transcriptional autoregulatory activity. Nevertheless, despite the target and its inhibitory mechanism has already been clarified, the biochemical asset of targeted cells and the DNA damage response regulation remains unclear.
Therefore, the aim of this study is the profiling of the mechanism of action of the DDIs lead compound E7, and its comparison to the one of 5-fluorouracil, a commonly used chemotherapy prodrug. Specifically, the study aimed to:
i. Identify the biochemical pathways involved in E7's mechanism of action;
ii. Examine how this mechanism evolves over time by analyzing the protein expression changes at 6 and 12 hours after drug administration;
iii. Compare the mechanism of action of E7 to that of 5FU, with a focus on the role of anti-thymidylate synthase drugs in regulating cancer cell response and providing insights into the molecular mechanisms involved.
iv. Identify possible off-target effects induced by treatment with DDis.
CRC cell cultures were treated with E7 compound and a chemotherapy drug, 5FU. Extracted proteins were processed with Filter-Aided Sample Preparation protocol and analyzed through quantitative label-free high resolution mass spectrometry technique. MS results were quantitatively analysed with PEAKS software to identify the Differentially expressed proteins, which underwent further bioinformatic exploration with different tools. The generation of enriched networks have allowed the identification and clusterization of the main biochemical and functional paths involved in drug response. The metadata were integrated with the outcome of a molecular analysis (immunofluorescence and Western Blot) run on the same samples, which evidenced the up-regulation of DNA-damage biomarkers.
On the bases of these premises, we have identified a panel of proteins, both from WB and from proteomics, which will be validated by functional assay.
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