Riassunto analitico
La timidilato sintasi umana (hTS) è un enzima chiave nella biosintesi del DNA poiché catalizza la formazione di un precursore essenziale per la formazione della catena. La sua attività consiste nella reazione di metilazione riduttiva del dTMP a partire dal dUMP utilizzando come donatore di metile il 5,10 mTHF. hTS rappresenta un target validato nella terapia antitumorale. Ad oggi i farmaci usati sono antimetaboliti che mimano il substarto (dUMP), come il 5-fluorouracile, o il cofattore,come il metotrexato. E’ stato ampiamente documentato come l’utilizzo prolungato di questi farmaci porti a fenomeni di farmaco resistenza. Tali farmaci agiscono bloccando la catalisi dell’enzima tramite legame competitivo al sito attivo. hTS nella sua forma attiva è un dimero formato da due monomeri invertiti di 180 °, è stato dimostrato che esiste un equilibrio tra la forma dimerica (attiva) e la forma monomerica (inattiva). Questo ha portato allo sviluppo di una nuova strategia per inibire l’enzima e all’individuazione di molecole, che tramite l’interazione all’interfaccia dei due monomeri, destabilizzano l’equilibrio e lo spostano verso la forma monomerica inattiva. Composti che agiscono in tal modo sono denominati “dimer disrupters” (Ddis). Il gruppo della Prof.ssa Maria Paola ha progettato e sintetizzato una libreria di oltre 250 composti a struttura tiofenilacetamidica capaci di interagire con TS. Tra le molecole progettate due sono state selezionale per le loro caratteristiche: E7 e AIC-A16. E7 rappresenta il Ddis più attivo di tutta la serie, mentre AIC-A16 sebbene molto attivo a livello dell’enzima ha mostrato una scarsa attività nei confronti delle linee cellulari di tumore colon rettale, per questo motivo è stato utilizzato come base per l’ottimizzazione strutturale atta ad incrementare l’attività verso le linee cellulati HT29 e HCT116. Poiché i due lead compounds mostrano sia una scarsa solubilità in acqua che la presenza di un gruppo tossicoforo (NO2), è stato svolto uno studio atto a progettare la sintesi di nuovi derivati più solubili e meno tossici tramite sostituzione del gruppo nitro. In uno studio antecedente al mio lavoro di tesi sono state sintetizzate 22 nuove molecole che hanno portato ad un incremento dell’attività biologica sulle linee cellulari mantenendo un’attività sull’enzima ricombinante paragonabile ad AIC-A16. Nel mio lavoro di tesi, con l’obiettivo di ottimizzare il lead AIC-A16 ed eE7, mi sono occupato dei seguenti aspetti:
1. progettazione di derivati di AIC-A016 mediante metodi di docking molecolare utilizzando la suite Maestro di Schrodinger;
2. sintesi di 13 molecole tra quelle progettate;
3. valutazione delle proprietà di inibizione dell’enzima hTS e degli indicatori per la caratterizzazione del loro possibile meccanismo dissociativo;
4. valutazione della loro capacità di inibire la crescita delle cellule di tumore colonretto (CRC) e di tumore ovarico;
5. Sintesi di un derivato di E7 e separazione tramite HPLC chirale degli enantiomeri.
I risultati ottenuti comprendono l’ottimizzazione della sintesi dei derivati a scaffold tiofenilacetamidico, l’ottenimento di 13 composti con purezza superiore al 97%, la separazione degli enantiomeri del derivato di E7 e la valutazione dell’attività biologica sia sull’enzima ricombinate che sulle linee cellulari di CRC. Dai risultati del mio lavoro di tesi sarà possibile individuare composti utili per la progressione dello studio verso modelli animali.
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