Riassunto analitico
La maggior parte delle cellule contiene una moltitudine di fosfolipasi che possono esistere come forme secrete, associate alla membrana o intracellulare. Nei mammiferi, le fosfolipasi C fosfoinositide-specifiche (PI-PLC) sono tredici isoenzimi, classificati in sei sottogruppi [β(1-4), γ (1 e 2), δ (1,3 e 4), ε, ζ, η (1 e 2)], in base alla loro struttura. Gli enzimi PI-PLC svolgono un ruolo chiave nella trasduzione del segnale idrolizzando il fosfatidilinositolo bifosfato (PIP2) che si trova nelle membrane cellulari a basse concentrazioni. Le PI-PLC hanno struttura lievemente diversa, presentando domini comuni e domini specifici ad ogni sottofamiglia. Alterazioni nella regolazione delle PI-PLC sono stati descritti in alcune condizioni patologiche, in quanto ci sono diversi meccanismi molecolari dipendenti dalla PI-PLC che sono associati all'attivazione o all'inibizione di importanti processi fisiopatologici. Nella presente tesi sperimentale, abbiamo studiato l’espressione delle PI-PLC negli osteoblasti umani quiescenti e dopo stimolazione con lipopolisaccaride batterico (LPS) mediante tecniche di biologia molecolare (PCR) e di immunocitochimica a fluorescenza. Negli osteoblasti quiescenti i geni espressi sono PLCB1, PLCB3, PLCG1, PLCG2, PLCD3, PLCH1, PLCH2.Dopo 3h dalla stimolazione con LPS, i trascritti dei geni PLCB2, PLCB3, PLCG1, PLCG2, PLCD3, PLCE, PLCH1, PLCH2 erano espressi. Dopo 6h dalla stimolazione con LPS vi è l’espressione delle isoforme PLCB2, PLCG1, PLCG2, PLCD1, PLCD3, PLCE, PLCH1, PLCH2. L’espressione dei geni PLC cambia ancora dopo 24H dalla stimolazione con LPS, l’unico gene del quale non si trova il trascritto è PLCB1, mentre vi è la presenza di una doppia banda per PLCB2. Dopo 48 ore dalla stimolazione con LPS compaiono tutte le isoforme delle PI-PLC con la permanenza della doppia banda per PLCB2, ma non sono espressi i trascritti dei geni PLCD1 e PLCD4. Anche la localizzazione delle PI-PLC negli osteoblasti cambia dopo stimolazione con LPS, negli osteoblasti quiescenti la isoforma PI-PLC β1 è prettamente nucleare, le isoforme PI-PLC β2, γ2, γ3 sono principalmente citoplasmatiche-perinucleari, le isoforme PI-PLC β3, δ3, δ4, ε, η1, η2 sono citoplasmatiche; negli osteoblasti stimolati con LPS, dopo 3 ore le isoforme PI-PLC β1 e PI-PLC β2 sono localizzate nella zona perinucleare, PI-PLC β3 nella zona nucleare, PI-PLC δ1, δ3 e δ4 nel citoplasma, PI-PLC ε, η1, η2 sia nel nucleo che nel citoplasma. Le isoforme appartenenti alla sottofamiglia PI-PLC η avevano nel citoplasma una distribuzione puntuata. Dopo 6 ore di stimolazione con LPS, PI-PLC ε è stata individuata nel nucleo e PI-PLC η2 nel citoplasma, con particolare localizzazione perinucleare. Dopo 24 ore di stimolazione con LPS si ripresenta lo stesso risultato delle 6 ore, PI-PLC ε viene individuata nel nucleo e PI-PLC η2 nel citoplasma, con localizzazione perinucleare. Dopo 48 ore di stimolazione con LPS, l’isoforma PI-PLC β1 è stata individuata nel nucleo, PI-PLC ε nel citoplasma, PI-PLC η1 nel citoplasma, con particolare localizzazione perinucleare, e PI-PLC η2 nel citoplasma.I risultati di questo studio mostrano che le PLC sono espresse negli osteoblasti e la loro espressione cambia dopo la stimolazione con LPS. La localizzazione delle PI-PLC è diversa negli osteoblasti quiescenti è prevalentemente citoplasmatica mentre negli osteoblasti stimolati dopo 3 ore la localizzazione rimane prettamente nucleare/citoplasmatica mentre dopo 24 ore migrano nel citoplasma; per quanto riguarda la trascrizione dei geni delle PLC nelle hOB quiescenti non troviamo la PLCE, D1, B4, B2 invece sono presenti nelle hOB stimolate. In conclusione, i dati ottenuti dagli esperimenti discussi suggeriscono che la via della trasduzione del segnale cui appartengono le PI-PLC sia attivata quando gli osteoblasti sono sottoposti a stimolo infiammatorio.
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