Riassunto analitico
L’80-90% dei tumori ovarici insorge in età compresa tra i 20 e i 65 anni, nella maggioranza dei casi si tratta di tumori benigni (80%) diagnosticati prima dei 40 anni, mentre il 20% dei tumori ovarici è maligno e viene diagnosticato in donne di età superiore ai 40 anni. Tra i fattori responsabili dello sviluppo del carcinoma ovarico sono state riscontrate mutazioni che interessano i geni oncosoppressori BRCA1/2, il fattore di crescita epiteliale vascolare VEGFR, l’enzima polimerasico PARP deputato alla riparazione dei danni al DNA: queste mutazioni rappresentano un target per le terapie a bersaglio molecolare. Inoltre, si sono osservare molecole del ciclo dei folati la cui funzione risulta particolarmente critica per la sintesi di DNA, tra queste la Timidilato Sintasi umana (hTS).
Dagli studi di Drug Discovery basati sulle informazioni strutturali del dimero di hTS, si è ottenuta una libreria di composti molecolarmente bilanciata, con core benzotiazolico diversamente decorato, aventi evidente specificità nei confronti di hTS con azione dissociativa, progettati sulla base di studi cinetici e termodinamici delle interazioni enzima-inibitore, studi dell’attività intrinseca con tecnica FRET, e studi in vitro per valutarne l’IC50. Da queste librerie sono stati selezionati dei candidati che hanno dimostrato possedere maggiore attività inibitoria e -ΔΦ elevato, tra questi LC1343 e AIC-C37 hanno dato buoni risultati nei test effettuati. Allo stesso modo, studi strutturali sul monomero enzimatico hanno evidenziato una tasca idrofobica all’interfaccia dei monomeri, sulla cui conformazione tridimensionale è stato progettato un octapeptide (LR), che stabilizza hTS nella forma di-inattiva, inibendone l’attività catalitica, favorendo la dissociazione dimerica e lasciando inalterate le funzioni regolatorie sull’mRNA. Al fine di favorire l’internalizzazione, è stata considerata la sovraespressione dei recettori del folato FRα in alcuni tipi di cellule tumorali. Ciò presuppone che il peptide LR, dotato intrinsecamente di attività farmacologica autonoma, adeguatamente derivatizzato con una molecola di acido folico (FA-LR) possa veicolare la moiety attiva attraverso FRα, promuovendone quali-quantitativamente l’uptake mirato.
Gli effetti collaterali dei chemioterapici classici aventi come target hTS contemplano il progressivo aumento della farmacoresistenza, espressa anche come aumento della concentrazione intracellulare di hTS. L’obiettivo del mio lavoro di tesi è quindi studiare la biodisponibilità cellulare di FA-LR, LC1343 e AIC-C37 attraverso la cinetica di internalizzazione in linee cellulari di carcinoma ovarico cisplatino resistenti. La linea cellulare IGROV-1 è stata esposta a 5µM E 500nM di FA-LR, mentre la linea C13* a una concentrazione 5µM dei composti LC1343 e AIC-C37. Dopo lisi osmotica della membrana esterna e pellettizzazione delle cellule, per separare la frazione proteica insolubile da quella citoplasmatica, ho eseguito l’analisi UHPLC-HRMS (Orbitrap Q-Ex™) del contenuto citosolico delle cellule trattate con FA-LR. Invece, per LC1343 e AIC-C37 il surnatante è stato analizzato in LC-MS/MS.
Dall’elaborazione dei risultati è emerso che i tre inibitori si accumulano all’interno della cellula con cinetiche diverse, presentano una buona stabilità citosolica nel tempo, che permette loro di esplicare l’attività farmacologica dissociativa di hTS per la quale sono stati progettati. È evidente che il tempo di permanenza all’interno della cellula e la loro stabilità è correlata con l’effetto di inibizione della crescita cellulare.
Sulla base delle conoscenze acquisite anche nel corso del presente lavoro di tesi, sarà possibile migliorare gli aspetti di internalizzazione ed accumulo all’interno della cellula, a favore di una maggiore ritenzione cellulare e di conseguenza una maggiore efficacia nell’azione antitumorale contro il tumore ovarico.
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