Riassunto analitico
Le cellule di lievito durante la fermentazione subiscono vari tipi di stress, tra cui lo stress indotto dall’etanolo, che può alterare la fluidità della membrana cellulare, comprometterne l’integrità e aumentarne la permeabilità. Lo scopo di questa tesi è stato quello di investigare gli effetti dello stress da etanolo in termini di crescita e di fluidità di membrana di 11 ceppi di lievito di interesse enologico, di cui 9 ceppi Saccharomyces (UMCC 6, UMCC 19, UMCC 3064, UMCC 3065, UMCC 3066, UMCC 24, UMCC 263, UMCC 20, UMCC 2592) e due non-Saccharomyces (UMCC 5, UMCC 15). Tali ceppi sono commercializzati da AEB S.p.a. e conservati presso la Unimore Microbial Culture Collection (UMCC). L'effetto dell'etanolo sulla crescita dei lieviti è stato valutato utilizzando terreni contenenti diverse concentrazioni di etanolo. Lo screening in terreno solido ha rivelato un'elevata tolleranza all'etanolo dei Saccharomyces fino a una concentrazione del 14%, mentre i non-Saccharomyces hanno mostrato una crescita compromessa a concentrazioni superiori al 10%. La crescita è stata testata anche in terreno liquido in termini di densità ottica. I ceppi di lievito sono stati testati al 10% e 14% di etanolo per i Saccharomyces, mentre per i non-Saccharomyces è stata selezionata una concentrazione intermedia del 5% e una maggiormente inibente del 10%. I Saccharomyces hanno mostrato una buona crescita al 10% di etanolo, al contrario i non-Saccharomyces hanno riportato una crescita ridotta. Sono state riscontrate differenze ceppo specifiche all’interno del genere non-Saccharomyces. In dettaglio, T. delbrueckii (UMCC 5) ha mostrato una crescita al 5% paragonabile al controllo non trattato, mentre M. pulcherrima (UMCC 15) ha mostrato una crescita ridotta alle medesime condizioni. Inoltre, l'effetto dell’etanolo sulla fluidità della membrana è stato valutato misurando la polarizzazione generalizzata del Laurdan (GP) mediante spettrofluorimetro. Si è osservato che i ceppi Saccharomyces, dopo 24h dal trattamento, mostravano un aumento della fluidità di membrana a basse concentrazioni di etanolo (10%) e una riduzione a concentrazioni più elevate (14%). Il ceppo UMCC 5 ha confermato un comportamento simile ai Saccharomyces. Al contrario, UMCC 15, ha mostrato un aumento di fluidità al 5% di etanolo e una diminuzione al 10%, che è persistita anche al 14%. L’aumento della fluidità sembrerebbe essere correlato ad una risposta cellulare indotta per contrastare l’effetto fluidificante dell’etanolo mentre la riduzione della fluidità, sia nel caso dei Saccharomyces che dei non-Saccharomyces può essere dovuta a due meccanismi. Nel caso dei Saccharomyces tale fenomeno sembra essere una risposta cellulare volta a contrastare l’effetto dell’etanolo. Al contrario, nel caso dei non-Saccharomyces l’irrigidimento della membrana cellulare può essere causato dalla diminuzione della vitalità cellulare, confermata dai ridotti valori di crescita precedentemente osservati. Infine, sono state effettuate indagini preliminari relative alla valutazione di integrità della superficie cellulare dei ceppi UMCC 3066 e UMCC 5 più rappresentativi in termini di crescita e fluidità di membrana, mediante l’utilizzo del microscopio a forza atomica (AFM). Le osservazioni evidenziano modificazioni morfologiche delle cellule trattate alle varie concentrazioni di etanolo rispetto al controllo non trattato, confermando come l’etanolo abbia un effetto anche sull’integrità della superficie cellulare. I risultati di questo lavoro di tesi rappresentano un ottimo punto di partenza per la comprensione dei meccanismi di adattamento dei lieviti allo stress da etanolo e lo sviluppo di ceppi resistenti, contribuendo a rendere maggiormente efficienti i processi fermentativi.
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