Riassunto analitico
La cellulosa batterica è un biopolimero sintetizzato da un vasto gruppo di microrganismi, tra cui agrobatteri, enterobatteri e batteri acetici. In tempi recenti la cellulosa batterica ha ricevuto una crescente attenzione industriale, in ambito alimentare, cosmetico e biomedico. La cellulosa batterica è biodegradabile, rinnovabile, biocompatibile e presenta caratteristiche strutturali che la rendono idonea in svariati impieghi. A fronte delle grandi potenzialità di impiego, la produzione industriale di cellulosa batterica presenta dei limiti principalmente legati alla disponibilità di ceppi microbici alto produttori in diverse condizioni di impiego. Tra i batteri acetici, Komagataeibacter xylinus è considerato l’organismo modello per gli studi di sintesi di cellulosa batterica. Il glucosio rappresenta la fonte di carbonio più comunemente utilizzata per la sintesi di cellulosa batterica, tuttavia esso non garantisce rese di cellulosa elevate anche a causa della sintesi preferenziale di metaboliti secondari come l’acido gluconico. Sulla base di tali premesse, il presente lavoro di tesi mira a valutare la capacità di produzione di cellulosa batterica in Komagataeibacter xylinus K2G30 e K2G30 knockout Δgdh. Sono stati studiati i ceppi K2G30 (UMCC 2756) wild type e K2G30 geneticamente modificato (Δgdh) in cui è stato silenziato il gene gdh responsabile della formazione di acido gluconico. Entrambi i ceppi sono stati posti a due diverse condizioni di coltura, la cui variabile è stata la concentrazione di glucosio nel mezzo di coltura, ovvero in condizioni ottimali (2% di glucosio (p/v)), ed in condizioni sub-ottimali in cui la concentrazione di glucosio è stata dimezzata rispetto al precedente (1% di glucosio (p/v)). In questo studio sono stati eseguiti saggi fenotipici volti a valutare la capacità di produrre cellulosa batterica in coltura liquida a diversi tempi di incubazione, sino a 15 giorni. A intervalli di 3 giorni, sono stati valutati: consumo di glucosio, produzione di acido gluconico e variazioni di pH. Tra i due ceppi di K2G30 si evidenzia una notevole differenza in termini di quantità di cellulosa batterica prodotta, che risulta essere complessivamente maggiore per il ceppo K2G30 Δgdh, indipendentemente dalla concentrazione di glucosio nel mezzo di coltura. In particolare, K2G30 wild type ha prodotto un quantitativo superiore di cellulosa batterica in condizioni ottimali di glucosio (2%), rispetto alle condizioni di coltura sub-ottimali di glucosio (1%). I dati ottenuti evidenziano inoltre una notevole differenza in acido gluconico prodotto in entrambe le condizioni di coltura. In particolare nel caso del ceppo K2G3 Δgdh non si è osservata nessuna variazione significativa della quantità di acido gluconico e conseguentemente una minima variazione di pH del mezzo. Il ceppo K2G30 wild type ha mostrato una maggiore quantità di acido gluconico accompagnata da una significativa diminuzione del pH, incidendo sulla resa di produzione di cellulosa batterica. I risultati di questo lavoro di tesi evidenziano l’efficienza del silenziamento del gene Δgdh in Komagataeibacter xylinus e l’importanza dell’ottimizzazione delle condizioni di coltura dei ceppi. I dati ottenuti costituiscono le conoscenze preliminari per l’ottenimento e lo sfruttamento industriale di ceppi della specie Komagataeibacter xylinus per la produzione di cellulosa batterica.
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Abstract
Bacterial cellulose is a biopolymer synthesized by a large group of microorganisms, including agrobacteria, enterobacteria and acetic bacteria. In recent times, bacterial cellulose has received growing industrial attention, in the food, cosmetic and biomedical fields. Bacterial cellulose is biodegradable, renewable and biocompatible, possessing structural properties that make it suitable for various uses. In view of the great potential of use, the industrial production of bacterial cellulose has limits mainly linked to the availability of high-producing microbial strains in different conditions of use. In view of the great potential of use, the industrial production of bacterial cellulose has limits mainly linked to the availability of high-producing microbial strains in different conditions of use. Among acetic bacteria, Komagataeibacter xylinus is considered the model organism for bacterial cellulose synthesis studies. Glucose is the most commonly used carbon source for the synthesis of bacterial cellulose, however it does not guarantee high cellulose yields also due to the preferential synthesis of secondary metabolites such as gluconic acid. Based on these considerations, the present thesis work aims to evaluate the bacterial cellulose production capacity in K. xylinus K2G30 and K2G30 knockout Δgdh. We studied the wild type K2G30 (UMCC 2756) and genetically modified K2G30 (Δgdh) strains in which the gdh gene responsible for the formation of gluconic acid was silenced. Both strains were cultivated under two different culture conditions, in which the concentration of glucose was changed. In detail, the strains were cultivated in standard conditions (2% glucose (w/v)), and in limiting conditions, in which the carbon source concentration was decreased (1% glucose (w/v)). In this study, phenotypic assays were performed to evaluate the ability to produce cellulose in liquid culture at different incubation times, up to 15 days. At 3-day intervals, glucose consumption, gluconic acid production and pH changes were evaluated. Between the two K2G30 strains there is a notable difference in terms of the amount of cellulose produced, which is overall greater for the K2G30 Δgdh, regardless of the concentration of glucose in the culture medium. In particular, K2G30 wild type produced a higher amount of cellulose under optimal glucose conditions (2%), compared to the limiting carbon source concentrations (1%). The data obtained also show a notable difference in gluconic acid produced in both culture conditions. In particular, in the case of the K2G30 Δgdh strain, no significant variation was observed in the gluconic acid amount, followed by minimum fluctuations of pH in the medium. K2G30 wild type strain showed a higher amount of gluconic acid accompanied by a significant decrease in pH, affecting the yield of bacterial cellulose production. The results of this thesis work highlight the efficiency of the silencing of the Δgdh gene in K. xylinus and the importance of optimizing the culture conditions of the strains. The data obtained stand for preliminary knowledge for in order to transfer the cellulose production using K. xylinus species at industrial level.
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