Riassunto analitico
Il riposizionamento dei farmaci (drug repurposing) rappresenta una valida alternativa alla progettazione de novo, rispetto alla quale offre maggiori probabilità di successo in tempi ridotti e a costi inferiori. Inoltre, uno dei fattori limitanti nello sviluppo tradizionale del farmaco è l’accessibilità sintetica dei composti; la strategia del riposizionamento consente di aggirare questa difficoltà, svelando nuove potenzialità terapeutiche per i composti già a disposizione. Nel mio lavoro di tesi, svolto presso il Molecular Modelling and Drug Design Lab, ho condotto una campagna di riposizionamento con lo scopo di identificare nuovi bersagli terapeutici per una libreria di composti precedentemente sintetizzati all’interno del gruppo di ricerca. A tal fine, ho messo a punto un approccio sistematico applicando ed integrando diversi metodi computazionali. Ho inizialmente effettuato un ligand-based virtual screening utilizzando il programma ROCS (OpenEye) per calcolare la similarità 3D della libreria di riferimento rispetto a composti provenienti dai database DrugBank, ChEMBL e Protein Data Bank (PDB). È noto, infatti, che strutture chimiche simili esibiscono spesso attività biologiche simili. Questa analisi ha evidenziato un elevato grado di similarità – sia in termini di forma molecolare che di pattern chimici – tra le molecole in esame e numerosi farmaci, composti attivi e ligandi cristallografici depositati nei tre database. L’analisi dei risultati, arricchita da un’accurata ricerca bibliografica, mi ha portato a identificare nell’Anidrasi Carbonica umana (hCA) un possibile target per un composto della libreria. Gli isoenzimi di questa famiglia svolgono un ruolo importante in molti processi fisio-patologici, e sono bersagli di agenti antiglaucoma, diuretici, antiepilettici e antitumorali. In particolare, nel mio progetto di tesi mi sono concentrata sulle isoforme II, IX e XII, di notevole interesse clinico. Successivamente, ho applicato un approccio structure-based per mettere alla prova i risultati ottenuti. Per ognuna delle isoforme di hCA selezionate, ho individuato una struttura cristallografica rappresentativa sulla base della similarità 3D tra il ligando co-cristallizzato ed il candidato al riposizionamento. Ho eseguito quindi esperimenti di docking molecolare con il software GLIDE (Schrödinger) sui recettori scelti, allo scopo di validare le nuove associazioni composto-target. Le pose predette hanno evidenziato una buona complementarietà sterica ed elettrostatica tra il composto e le proteine, con risultati meritevoli di verifica sperimentale. Pertanto, sono stati effettuati saggi biologici in vitro sulle diverse isoforme di hCA, ed è stata rilevata una costante di inibizione basso-nanomolare e una significativa selettività per hCA II per il composto investigato. Il composto è stato ulteriormente caratterizzato mediante risoluzione cristallografica a raggi X in complesso con hCA II. Nella parte finale del mio lavoro di tesi ho quindi potuto analizzare la struttura cristallografica così ottenuta, ricavando informazioni utili per una futura ottimizzazione.
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Abstract
Drug repurposing (also referred to as drug repositioning) represents a valuable alternative to de novo drug design, providing a greater success rate with reduced times and costs. Moreover, traditional drug development routes are often limited by compounds synthetic feasibility. Drug repositioning allows to circumvent this difficulty, unveiling novel therapeutic potentials for already available compounds.
In my thesis project, carried out in the Molecular Modelling and Drug Design Lab, I performed a repositioning campaign on a library of compounds previously synthetized by the research group. To this aim, I devised a systematic approach to identify possible pharmacological targets, applying different computational methods in an integrated protocol.
Firstly, I performed a ligand-based virtual screening using ROCS (OpenEye). In this task, I calculated 3D similarity of the query library molecules with respect to compounds extracted from the DrugBank, ChEMBL and Protein Data Bank (PDB) databases. Indeed, it is well-known that similar chemical structures tend to exhibit similar bioactivities. This analysis highlighted a notable degree of similarity between the reference compounds and several drugs, known actives and crystallographic ligands deposited in the three databases, both in terms of molecular shape and chemical patterns. Results analysis, enriched by an accurate bibliographic research, led to the identification of human Carbonic Anhydrase (hCA) as a possible target for one of the investigated compounds. Members of hCA isozyme family play roles of pivotal relevance in many physiopathological processes, and are targets for antiglaucoma, diuretic, antiepileptic and antitumor agents. In particular, in my thesis project I focused on clinically relevant hCA isoforms II, IX e XII.
In the subsequent structure-based part of the project, I selected representative crystal structures of hCA II, hCA IX and hCA XII based on 3D similarity between co-crystallized ligands and the repositioning candidate. Then, I ran molecular docking calculations on the chosen receptors using GLIDE software (Schrödinger), in order to validate the new compound-target associations. The predicted poses revealed a good steric and electrostatic complementarity between compound and proteins, and the overall findings were therefore deemed worthy of experimental testing.
In vitro biological assays of the investigated compound on various hCA isoforms were performed, disclosing a low-nanomolar inhibition constant and a remarkable selectivity towards hCA II. To further characterize the compound, a complex with hCA II was resolved by means of X-ray crystallography. Thus, in the last part of my thesis project I analysed the obtained crystal structure, gaining useful hints for further optimization.
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