Riassunto analitico
β-glucosidasi (E.C. 3.2.1.21) è una classe di idrolasi che agisce sui legami beta-glicosidici di diversi substrati. Durante la vinificazione, la presenza di questa attività enzimatica è associata alla modulazione dell’aroma del vino.
Sebbene molti studi abbiano dimostrato che vi è una significativa attività β-glucosidasica in lieviti non-Saccharomyces, pochi articoli scientifici hanno evidenziato questa attività enzimatica in lieviti appartenenti al genere Saccharomyces, che è il genere più ampiamente applicato nella produzione di vino.
Lo scopo del presente lavoro è il recupero di ceppi di lievito β-glucosidasi positivi appartenenti al genere Saccharomyces. L'analisi è stata condotta su ceppi di S.cerevisiae e S.uvarum per l’impiego industriale diretto o, in alternativa, per il loro inserimento in programmi di miglioramento genetico.
L'attività β-glucosidasica è stata testata da un punto di vista qualitativo e quantitativo su 88 ceppi di lievito Saccharomyces appartenenti alla collezione UMCC (Unimore Microbial Colture Collection). L’analisi qualitativa è stata condotta attraverso tre differenti saggi, in particolare basati sull’ idrolisi di cellobiosio, arbutina e esculina. Durante questa fase sperimentale, i metodi basati sull’idrolisi dei cromogeni arbutina e esculina sono risultati gli unici significativi: solo quei ceppi che hanno mostrato doppia positività per questi substrati sono stati selezionati per le successive fasi sperimentali.
Inoltre, l'attività β-glucosidasica è stata valutata quantitativamente mediante un saggio spettrofotometrico basato sull’ idrolisi di p-NPG. L’analisi è stata effettuata sul surnatante, sul lisato cellulare e su cellule intere: tale procedura è stata condotta con il fine di comprendere se l’enzima viene secreto , se rimane delimitato nello spazio intracellulare o associato alla parete/membrana del lievito.
Sui ceppi candidati, successivamente, è stata condotta un’analisi molecolare al fine di dimostrare la presenza del gene codificante la proteina. Sono stati utilizzati quattro primers degeneri progettati sulla base di precedenti lavori relativi a questo argomento e sull’allineamento di sequenze multiple del gene β-glucosidasi appartenente a specie affini. La scelta dei primers è stata finalizzata all’amplificazione di due segmenti genici aventi rispettivamente lunghezza di 200pb e 400pb.
Infine sono stati effettuati studi fermentativi in mosto sintetico sui ceppi selezionati con il fine di valutare la loro attitudine durante il processo di vinificazione. Tutti i metaboliti presenti nel vino sono stati analizzati per mezzo di un apparato HPLC.
Lo screening fenotipico di 88 ceppi evidenzia un’elevata frequenza dell’attività β-glucosidasica nella specie S.uvarum superiore a quella in S.cerevisiae. Il 61% dei ceppi appartenenti alla specie S.uvarum è risultata positiva sia in piastre con arbutina che con esculina, mentre solo il 24% dei ceppi S.cerevisiae ha mostrato attività enzimatica in entrambi i saggi.
Il saggio quantitativo supporta il risultato qualitativo in quanto è stata ritrovata un’elevata attività enzimatica nei ceppi candidati. In particolar modo l’attività enzimatica è stata rilevata principalmente nelle cellule intere mentre i risultati sono meno significativi per l’estratto cellulare e per il surnatante. Questo suggerisce che l’integrità della struttura cellulare è necessaria per il corretto lavoro dell’enzima.
L’amplificazione del gene tramite PCR non ha permesso di ottenere alcun prodotto nei ceppi candidati. Comunque questo può essere dovuto a un non sufficiente annealing dei primer sulle sequenze target. Ciò conduce a differenti scenari: infatti i risultati positivi ottenuti con lo screening in piastre di arbutina ed esculina potrebbero essere dovuti dalla presenza di enzimi ancillari come altri enzimi appartenenti alla famiglia delle glicosidasi.
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Abstract
β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21) is a class of hydrolases that act on the β-glycosidic bonds of different substrates.
During vinification, the presence of this enzymatic activity is associated with the enhancement of wine flavor.
Although many studies have shown that there is a significant β-glucosidase activity in non-Saccharomyces yeasts, just a few scientific papers highlighted this enzymatic activity in yeast belonging to the genus Saccharomyces, which is the most widely applied in wine production.
The aim of the present work is the retrieval of positive β-glucosidase yeast strains belonging to the Saccharomyces genus. The analysis was conducted on strains of S.cerevisiae and S.uvarum for their direct industrial exploitation or, alternatively, for their insertion into genetic improvement programs.
The β-glucosidase activity was tested on 88 Saccharomyces strains belonging to the UMCC (Unimore Microbial Culture Collection) both in a qualitative and a quantitative manner. Three different qualitative assays were used to evaluate the presence of β-glucosidase activity. The assays were respectively based on the hydrolysis of Cellobiose, Arbutin and Esculin. During this experimental phase, the methods based on the chromogenic hydrolysis of Arbutin and Esculin were found to be the only significant ones: double positivity was thus taken as indication of actual β-glucosidase activity. A quantitative assay was subsequently carried out through a spectrophotometric assay based on the hydrolysis of p-NPG. The analysis was operated on culture supernatants, on cell lysates and on whole cells: this was aimed at understanding whether the putative enzyme is secreted, intracellular or associated with the wall/membrane, respectively.
A molecular screening was also conducted on the candidate strains, in order to prove the presence of the protein-encoding gene. A set of four degenerate primers was used: the primers were designed on conserved regions of the β-glucosidase gene, based on previous papers concerning this topic and on the multiple sequence alignment of β-glucosidase genes belonging to related species. The choice of the primers was aimed at amplifying a 200 bp and a 900 bp gene segment.
Finally, the selected strains were applied to fermentative trials in synthetic must, in order to assess their wine-making aptitude. All wine-related metabolites were analyzed by means of an HPLC Apparatus.
The phenotypic screening of the 88 strains highlighted a high frequency for β-glucosidase activity in the species S.uvarum, superior to the one of S. cerevisiae. 61% of the strains belonging to the species S.uvarum resulted positive on both Arbutin and Esculin plates, while only 24% of S. cerevisiae strains showed enzymatic activity in both assays.
Remarkably, the quantitative assay was consistent with the qualitative one, as higher activity values were found for the candidate strains. More in particular, the enzymatic activity was mainly detected for whole cells, while the results are less significant when considering supernatants and cell lysates. This suggests that the integrity of the cellular structure is necessary for the enzyme to work properly.
The PCR amplification of the gene did not yield any product in the candidate set. However, this could due to a not-so-efficient annealing of the primers on the target sequences. One could also imagine different scenarios for this case-study: in fact, the positive results for the screening with both Arbutin and Esculin could be due to the presence of ancillary enzymes such as other enzymes belonging to the glycosidase family.
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