Riassunto analitico
Le nanoparticelle polimeriche (NPs) rappresentano attualmente uno dei più promettenti strumenti di drug-targeting e drug-delivery. Tuttavia, l'effettiva applicazione delle NPs nel campo della medicina richiede ancora un approfondimento delle conoscenze relative la loro interazione con sistemi biologici complessi. A seguito della somministrazione endovenosa, le proteine plasmatiche tendono ad associarsi alle NPs, originando una nuova superficie detta 'protein corona' (PC), che può avere un impatto sulla biodistribuzione, sul direzionamento e sulla tossicità delle NPs verso l'organismo. La PC è distinta in due componenti, dette 'hard' e 'soft' corona, rispettivamente formate da proteine legate in modo più stabile o più labile alla superficie della nanoparticella stessa. In letteratura sono riportati diversi studi che tentano di analizzare la hard corona, più facilmente isolabile e riproducibile, mentre la composizione e il ruolo della soft corona sono ancora sconosciuti, principalmente a causa delle difficoltà nel simulare tale condizione negli studi in vitro e preservare questo strato proteico dopo le procedure di purifica. Questa tesi è stata incentrata sullo studio sia della hard che della soft corona di tre diversi tipi di NPs, ovvero NPs di acido poli(lattico-co-glicolico) non modificate (PLGA-NPs) oppure funzionalizzate con ligandi di diversa natura in grado di direzionare le NPs verso il sistema nervoso centrale (SNC): il peptide g7 e l'anticorpo monoclonale OX26 (g7-NPs e OX26-NPs, rispettivamente). Gli obiettivi principali di questo lavoro di tesi sono stati l'allestimento di un protocollo sperimentale per lo studio della soft corona e l'identificazione di eventuali differenze nelle composizioni di hard e soft corona dei tre diversi nanosistemi. Inizialmente, le NPs sono state incubate in plasma umano e la variazione del diametro dei diversi sistemi è stato monitorata nel tempo tramite DLS. L’interazione proteina/NPs porta alla ri-formulazione di tre sistemi con caratteristiche dimensionali diverse. In particolare, dopo 20 minuti di incubazione, si è osservato l’incremento significativo del diametro medio delle NPs non modificate rispetto alle g7- e alle OX26-NPs, i cui gruppi funzionalizzanti potrebbero essere in grado di rallentare l'adsorbimento delle proteine. Si è pertanto deciso di indagare in maniera più approfondita la composizione di hard e soft corona, tenendo costante il tempo di incubazione di 20 minuti. La composizione della hard corona, indagata tramite analisi LC-ESI-Q-TOF-MS appare simile per tutte le tipologie di NPs con prevalenza di apolipoproteina E. La soft corona è stata analizzata tramite un nuovo protocollo (studiato ed ottimizzato ad hoc sulle particelle suddette in definite condizioni operative, così da fornire un dato sensibile della valutazione della associazione più flessibile e scambiabile) basato su cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), SDS-PAGE, saggio BCA e LC-ESI-Q-TOF-MS. La procedura sperimentale è stata dapprima testata utilizzando un sistema monoproteico, ovvero una soluzione di fibrinogeno umano, poi applicata allo studio della soft corona in plasma. Anche in questo caso non sono state riscontrate differenze in termini di composizione della soft corona: albumina e altre proteine, tipicamente abbondanti nel plasma, risultano essere le maggiori componenti, mentre l’apolipoproteina E è presente solo in tracce. Tuttavia la quantità di proteine/NPs misurata in questo esperimento ha confermato la tendenza, già osservata in precedenza, delle PLGA-NPs ad assorbire una maggior quantità di proteine. La differenza nelle composizioni di hard e soft corona, se da un lato conferma la necessità di allestire protocolli ottimizzati e settati in modo diverso per analizzare le due componenti della PC, dall’altro valida l’approccio sperimentale.
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Abstract
Nanoparticles (NPs) represent to-date one of the most promising tools in drug-targeting and drug-delivery. However, NPs efficacious application in medicine still requires a deeper understanding of their interaction with complex biological systems. After parenteral administration, plasma proteins tend to associate to NPs, forming a new surface named 'protein corona' (PC), which may impact on NPs biodistribution, targeting activity and toxicity towards the organism. The PC consists of two components, namely, 'hard' and 'soft' corona, respectively formed by strongly attached and loosely bound proteins to the NPs surface. Several studies have attempted to study hard corona, which is easier to isolate and reproduce, while both composition and role of soft corona are still unknown, mainly due to the difficulties in simulating such condition within in vitro studies and in preserving this protein layer after purification.
This thesis focused on the study of both hard and soft corona considering three different types of NPs, namely poly(lactic-co-glycolic acid) NPs, blank (named PLGA-NPs) or functionalized with vectors able to target the central nervous system (g7 peptide leading to g7-NPs and monoclonal antibody OX26 leading to OX26-NPs). The main goals of this project consist of the design of a protocol for the study of the soft corona and the identification of eventual differences between compositions of hard and soft corona of the three different nanocarriers.
At first, NPs were incubated in human plasma and the diameter variation of each nanosystem was evaluated over the time through DLS. The protein/NPs interaction leads to the re-formulation of three systems with different size features. In particular, after 20 minutes of incubation we observed a relevant increase of un-modified PLGA-NPs diameter in comparison to g7- and OX26-NPs, whose functionalizing groups may be able to slow down protein adsorption.
Therefore, hard and soft corona compositions were in depth investigated by keeping constant incubation time of 20 minutes, which corresponds to the highest extent of PC around PLGA-NPs.
Hard corona composition, analyzed through LC-ESI-Q-TOF-MS, was similar amongst all three NPs types, with a predominance of apolipoprotein E.
Soft corona was analyzed with a new protocol, designed and optimized on these kinds of NPs in selected experimental conditions, in order to provide an evaluation of the more flexible and exchangeable association. This procedure was based on size exclusion chromatography (SEC), SDS-PAGE, BCA assay and LC-ESI-Q-TOF-MS and tested on a mono-protein system first (i.e. human fibrinogen solution), then applied to the study of soft corona in plasma.
Also in this case, no difference in composition of the soft corona emerged: albumin and other typical abundant plasma proteins were the main components, while apolipoprotein-E was only present in traces. However, the protein/NPs ratio measured in this experiment confirmed the tendency of PLGA-NPs to adsorb a greater amount of proteins, as previously observed. The divergence in composition of hard and soft corona confirms that the design of optimized protocols for differential analysis of the two components is required, emphasizing and validating , at the same time, our experimental approach.
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