Riassunto analitico
Negli ultimi anni, l’ambito della ricerca riguardante le terapie antitumorali ha mostrato un crescente interesse nei confronti della Hippo Pathway, una via di segnalazione intracellulare il cui malfunzionamento è un fattore chiave alla base della genesi tumorale. La Hippo Pathway influenza la proliferazione, la differenziazione e la sopravvivenza delle cellule, svolgendo un ruolo fondamentale nello sviluppo degli organi e nel mantenimento dell’omeostasi. La disregolazione di questo percorso può provocare una serie di malattie, tra cui il cancro e disfunzioni del sistema immunitario. Quando la cascata chinasica della Hippo Pathway è attiva, porta alla fosforilazione di YAP (Yes-associated protein) che rimane a livello citoplasmatico e viene degradato. Quando la cascata chinasica è inattiva, YAP non fosforilato migra nel nucleo, lega e attiva i fattori di trascrizione hTEAD1-4 stimolando l'espressione di geni legati alla sopravvivenza e alla proliferazione cellulare. Il complesso YAP:hTEAD è quindi un promettente bersaglio per nuovi farmaci antitumorali. È perciò importante sviluppare programmi di drug discovery mirati a studiare nuove molecole inibitori dell’interazione YAP: TEAD che, di conseguenza, inibiscono la proliferazione cellulare. A questo scopo il gruppo di ricerca in cui ho svolto il mio lavoro di tesi, sviluppa nuovi composti con questo profilo. Per lo sviluppo di nuovi farmaci che inibiscano l’interazione YAP: TEAD è necessario avere a disposizione la proteina target, TEAD YBD (YAP Binding Domain). L’obiettivo principale del mio elaborato di tesi consiste nello studio della produzione e purificazione della proteina e della sua caratterizzazione mediante tecniche chimico fisiche (spettrometria di massa, gel elettroforesi) e spettroscopiche (dicroismo circolare). Per raggiungere questi risultati mi sono occupata direttamente delle seguenti attività: 1) Ottimizzazione della purificazione della proteina ricombinante hTEAD YBD wt per poterla utilizzare in studi di binding con nuovi inibitori e per studi strutturali. Per raggiungere questo obiettivo ho sviluppato i seguenti protocolli: a. Ottimizzazione della procedura di scale-up e pelletizing di His6-hTEAD YBD wild type (aa 217-434); b. Ottimizzazione della purificazione di His6-hTEAD YBD wild type (aa 217-434) in cellule di E. Coli ArcticExpress (DE3) rese competenti con il plasmide pET15b-HIS6-Nthrombin. 2) La caratterizzazione strutturale di hTEAD4 tramite l’analisi del dicroismo circolare. L'analisi del dicroismo circolare (CD) permette di monitorare la conformazione della proteina. Per raggiungere questo obiettivo ho sviluppato i seguenti protocolli: a. Ottimizzazione dell’analisi strutturale attraverso la tecnica del dicroismo circolare CD nel campo del FarUV e del NearUV di His6-hTEAD YBD wild type (aa 217-434); b. Studio dell’influenza del Nichel e dell’imidazolo, impiegati durante il processo di purificazione, sull’analisi strutturale di His6-hTEAD YBD wild type (aa 217-434) attraverso la tecnica del dicroismo circolare. In conclusione, questo mio elaborato di tesi ha chiarito i motivi per cui la purificazione della proteina hTEAD non è più ottimale rispetto all'inizio dell'arrivo del plasmide, quantificando la stabilità del plasmide nel tempo e nei diversi buffer impiegati per le analisi. Questi protocolli costituiscono una base per future ricerche nel laboratorio di Drug Discovery and Biotechnology, migliorando la comprensione strutturale delle proteine. Il mio lavoro ha evidenziato l'importanza delle tecniche spettroscopiche nella determinazione delle proprietà strutturali delle proteine, con potenziali applicazioni anche in ambito terapeutiche.
|
