• distribuzione
• HPLC-MS/MS
• OAT
• p-cresolo
• probenecid

Il p-cresolo è un composto organico con struttura fenolica e caratterizzato da una notevole volatilità ed un odore sgradevole. Esso può essere rilasciato dall’acqua piovana, dal petrolio, dalle plastiche e da molti altri materiali; l’esposizione ambientale è molto comune e può avvenire tramite la cute, per inalazione o per ingestione. Esso, nell’organismo, viene principalmente prodotto da alcuni batteri intestinali, tra cui il Clostridium difficile e lo Pseudominas stutzeri, i quali esprimono la p-idrossifenilacetato deidrogenasi che è un enzima in grado di convertire il p-idrossifenilacetato, derivante dalla tirosina, a p-cresolo. Una volta prodotto, viene metabolizzato in due metaboliti: il p-cresil-glucoronide e il p-cresil-solfato. Quest’ultimo, insieme al p-cresolo stesso, viene trasportato nelle urine dai trasportatori di anioni organici (OAT), che sono anche responsabili del suo efflusso a livello della barriera emato-encefalica.
Il p-cresolo, insieme ai suoi metaboliti, sembra essere coinvolto in numerose patologie. Infatti, è il capostipite delle tossine uremiche legate alle proteine plasmatiche e può portare a gravi complicazioni cardiovascolari, del sistema nervoso centrale e del sistema immunitario in pazienti affetti da insufficienza renale cronica (CKD). È stato suggerito che il p-cresolo contribuisca al peggioramento della sintomatologia dell’autismo e sono state rilevate concentrazioni elevate rispetto alla norma di p-cresil-solfato nelle urine di bambini autistici, che avevano alterazioni del microbiota intestinale. Inoltre, è stato visto che il p-cresolo può interferire con il metabolismo della dopamina suggerendo un suo coinvolgimento nella fisiopatologia del disturbo post-traumatico da stress (PTSD) e del morbo di Parkinson, nel quale questo neurotrasmettitore gioca un ruolo chiave. Tuttavia, evidenze sulla presenza e concentrazione del p-cresolo nel sistema nervoso centrale (SNC) sono praticamente assenti. Da qui emerge la necessità di sviluppare un metodo analitico capace di quantificare il p-cresolo in modo preciso ed accurato a livello del SNC.
Durante questo lavoro di tesi sperimentale di Laurea Magistrale di Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stato ottimizzato un metodo analitico HPLC-MS/MS per la quantificazione del p-cresolo, andando a calcolare i parametri sperimentali e a determinare le più efficienti condizioni di estrazione, di separazione cromatografica e di spettrometria di massa. Questo metodo è stato poi applicato su tessuti cerebrali di topi adulti C57BL6 maschi e femmine. Successivamente è stata studiata l’espressione dei trasportatori OAT e la loro possibile interazione con p-cresolo e probenecid (un noto inibitore degli OAT). Lo studio è stato eseguito in vitro, analizzando le quantità di analita in terreni condizionati di cellule neuronali HT-22 trattate con p-cresolo o p-cresolo + probenecid. L’interazione con questi trasportatori è stata ulteriormente approfondita tramite un docking molecolare, in modo da confrontare i legami tra gli OAT e i vari metaboliti.
Per il futuro, il passo successivo sarà quello di studiare dettagliatamente in vitro e in vivo, se un’azione su questi trasportatori possa ridurre l’accumulo di p-cresolo e dei suoi metaboliti a livello centrale, riducendone la tossicità. Questi risultati potrebbero indicare gli OAT come possibili bersagli terapeutici per migliorare la sintomatologia e le condizioni di pazienti affetti da autismo, PTSD e morbo di Parkinson.

p-cresol is an organic compound with a phenolic structure and characterized by considerable volatility and an unpleasant odor. It can be released from rainwater, oil, plastics and many other materials; Environmental exposure is very common and can occur through the skin, inhalation or ingestion. In the body, it is mainly produced by some intestinal bacteria, including Clostridium difficile and Pseudominas stutzeri, which express p-hydroxyphenylacetate dehydrogenase which is an enzyme capable of converting p-hydroxyphenylacetate, deriving from tyrosine, to p-cresol. Once produced, it is metabolized into two metabolites: p-cresyl-glucuronide and p-cresyl-sulfate. The latter, together with p-cresol itself, is transported in the urine by organic anion transporters (OATs), which are also responsible for its efflux at the blood-brain barrier. p-cresol, together with its metabolites, appears to be involved in numerous pathologies. In fact, it is the progenitor of uremic toxins bound to plasma proteins and can lead to serious cardiovascular, central nervous system and immune system complications in patients suffering from chronic renal failure (CKD). It has been suggested that p-cresol contributes to the worsening of autism symptoms and higher than normal concentrations of p-cresyl sulphate have been detected in the urine of autistic children, who had alterations in the intestinal microbiota. Furthermore, it has been seen that p-cresol can interfere with the metabolism of dopamine, suggesting its involvement in the pathophysiology of post-traumatic stress disorder (PTSD) and Parkinson's disease, in which this neurotransmitter plays a key role. However, evidence on the presence and concentration of p-cresol in the central nervous system (CNS) is practically absent. From here emerges the need to develop an analytical method capable of quantifying p-cresol precisely and accurately at the CNS level. During this experimental thesis work for the Master's Degree in Pharmaceutical Chemistry and Technology, an HPLC-MS/MS analytical method was optimized for the quantification of p-cresol, calculating the experimental parameters and determining the most efficient extraction and separation conditions. chromatography and mass spectrometry. This method was then applied to brain tissues from adult male and female C57BL6 mice. Subsequently, the expression of OAT transporters and their possible interaction with p-cresol and probenecid (a known OAT inhibitor) was studied. The study was performed in vitro, analyzing the quantities of analyte in conditioned media of HT-22 neuronal cells treated with p-cresol or p-cresol + probenecid. The interaction with these transporters was further explored through molecular docking, in order to compare the links between OATs and the various metabolites. For the future, the next step will be to study in detail in vitro and in vivo whether an action on these transporters can reduce the accumulation of p-cresol and its metabolites at a central level, reducing their toxicity. These results could indicate OATs as possible therapeutic targets to improve the symptoms and conditions of patients suffering from autism, PTSD and Parkinson's disease.