• age
• gender.
• obesity
• steatosis
• Zebrafish

L’obesità è una malattia complessa caratterizzata da un eccessivo accumulo di grasso nell’organismo che si viene a determinare a causa dell’eccesso di calorie introdotte con la dieta. È un fattore di rischio indipendente di diverse patologie, come le malattie cardiovascolari, il diabete mellito di tipo 2, la dislipidemia e l’insulino-resistenza. Numerosi dati supportano l'esistenza di una stretta relazione tra l’eccesso di peso corporeo e la NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease), una malattia che va dalla steatosi epatica alla steatoepatite (NASH), fibrosi, cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC), anche se questa correlazione non è stata del tutto esaminata. Tra i vertebrati, lo Zebrafish è simile ai mammiferi per i suoi processi di sviluppo e di metabolismo; è un modello relativamente nuovo che offre diversi vantaggi rispetto a quelli tradizionali: veloce, economico e simile all’uomo. Infatti l’apparato gastro-intestinale, il tessuto adiposo e il muscolo scheletrico dello Zebrafish sono organizzati in maniera sovrapponibile alla controparte umana. Sono state riportate (Hölttä-Vuori, 2010) analogie marcate nel metabolismo dei lipidi, compreso il loro trasporto inter-organi: come nell’uomo, i grassi assorbiti con l’alimentazione vengono trasferiti dall'intestino al fegato e da qui ai tessuti extra-epatici.
Lo scopo di questo lavoro è stato creare un modello di malattia epatica in Zebrafish, in una condizione associata all’obesità, che potrebbe essere utilizzato per comprendere i principali meccanismi molecolari coinvolti nella progressione della NAFLD associata dall’obesità. Sono state valutate le differenze fisiologiche dovute all'età e al sesso che potrebbero essere coinvolte nello sviluppo dell’obesità. A tale scopo gli Zebrafish suddivisi in maschi/femmine giovani e vecchi sono stati assegnati a due gruppi alimentati con modalità differenti: un gruppo con 20 mg di cisti/pasto tre volte al giorno (overfeeding) e il gruppo di controllo con 5 mg di cisti/pasto una volta al giorno. Durante lo studio, condotto per 24 settimane, è stato misurato l’indice di massa corporea (BMI) ogni settimana; a vari time points (settimana 1, 6, 16, 24) gli animali sono stati sacrificati per analizzare l’istopatologica e l’espressione genica del fegato. Già dalla prima settimana di trattamento è stato osservato un significativo aumento del BMI (p <0,001), negli animali in overfeeding rispetto ai controlli.. Tutti gli animali hanno sviluppato obesità e steatosi: ciò indica che la penetranza di questo modello è il 100%. Colorando con ematossilina-eosina osserviamo che la steatosi è evidente a partire dalla prima settimana, invece con sirius red abbiamo rilevato la formazione di piccoli depositi di collagene a partire dalla settimana 24. È da segnalare che le femmine giovani sviluppano meno steatosi e non manifestano fibrosi rispetto agli altri gruppi. L’immunoistochimica di sezioni di fegato ha mostrato apparentemente un aumento della marcatura citoplasmatica e nucleare di fosfo-ERK1/2, una pathway nota per essere coinvolta nello sviluppo dell’iperpalsia e dell’HCC. L'analisi di Real Time PCR di geni coinvolti nel metabolismo lipidico (PPARα, PPARγ, SREBP1c e C/EBPA), nel metabolismo dei carboidrati (Creb3L3 e Ampka), infiammazione (TNF, IL-6, IL-1), fibrosi (TGFβ) e tumorigenesi (IGF-2 PSMD-10, cMyc, AKT e mTOR) ha rivelato un modello che è coerente con la NAFLD.
I nostri dati suggeriscono che lo Zebrafish è un modello prezioso per studiare la malattia del fegato in condizioni associate all’obesità, anche in una prospettiva di distinzione tra età e sesso. Di nota è il rapido sviluppo di steatosi e l’attivazione di pathways simili a quelle dell’uomo; ciò rende questo modello attraente per lo studio dei meccanismi fisiopatologici nei primi stadi di sviluppo della fibrosi.

Obesity is a complex disease characterized by an extra accumulation of fat in the organism mostly due to an excess of calories with diet. Obesity is an independent risk factor for several diseases such as cardiovascular diseases, type 2 diabetes mellitus, dyslipidaemia and insulin resistance. Several data support the existence of a close relationship between body overweight and NAFLD, (non-alcoholic fatty liver disease) a complex disease, which goes from simple hepatic steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), even if this correlation is not completely investigated. Among the vertebrates, Zebrafish resembles mammals in its developmental and metabolic processes; is a relatively new model that offers several advantages over the traditional ones: fast, cheap and close to humans. The digestive organ, adipose tissue and skeletal muscle of the Zebrafish are physically organized in a manner similar to their human counterpart. Marked similarities in lipid metabolism, including inter-organs transport has been reported by Holtta-Vuori (2010): as in humans, the absorbed dietary lipids are delivered from the intestine to the liver and from there to extra-hepatic tissues. The aim of this study was to set up a model of liver disease in obesity associated condition in Zebrafish that could be used to get into the main molecular mechanisms explaining the progression of NAFLD due to obesity. As physiological differences due to age and gender could be involved in the development of obesity, we also evaluated age and gender differences. To this aim both young and old male/female Zebrafish were assigned to two different dietary groups: one group was overfed with 20 mg of cyst/meals three times a day and the control group was fed with 5 mg of cysts/meal once a day. Throughout the initial part of the study (lasting 24 weeks), body mass index (BMI) was measured weekly; at various time points (week 1, 6, 16, 24), animals were sacrificed to collect the liver for histo-pathologic and gene expression analysis. A significant increase in BMI (p<0,001) can be observed in overfed versus controls animals already after one week of overfeeding. All animals developed obesity and steatosis indicating that the penetrance of this model is 100 %. Hematoxylin-eosin staining demonstrated the presence of steatosis from the first week of overfeeding on while Sirius-red staining revealed the formation of small collagen deposits after week 24. Of note young females developed less steatosis and did not develop fibrosis as compare to young/old male or old female. Immunohistochemistry of liver sections showed enhanced cytoplasmic and nuclear staining of phospho-ERK1/2, a pathway that is known to be involved in the development of liver hyperplasia and HCC. Analysis by Real Time PCR of genes known to be involved in lipid metabolism (PPAR, PPAR, SREBP1c and C/EBPA), in carbohydrate metabolism (Creb3L3 and Ampka), inflammation (TNF , IL-6, IL-1), fibrosis (TGFβ) and tumorigenesis (IGF-2 PSMD-10, cMyc, AKT and mTOR) revealed a pattern that is consistent with NAFLD. Our data suggest that Zebrafish is a valuable model to study the liver disease in conditions associated with obesity, with demonstrable differences according to age and gender. The rapid development of steatosis and activation of pathways similar to humans, makes this model an attractive model for the study of physiopathological mechanisms in the early stages of fibrosis development. The increase of fibrosis observed after 24 weeks of overfeeding suggest that this model can be by all means a good experimental model of NAFLD.