Riassunto analitico
I materiali alla nanoscala sono di grande interesse nella ricerca per le loro dimensioni simili alle biomacromolecole ed il grande rapporto area di superficie-volume che favorisce le interazioni con le cellule viventi. Le nanoparticelle di argento (Ag NP) sembrano essere buone candidate per conferire capacità protettive verso le infezioni ai sostituti cutanei che proteggono le ferite. La tecnica dell’elettrofilatura permette di ottenere membrane di NF composte da materiali polimerici coniugati con agenti antimicrobici di dimensioni nanometriche, dotate di elevata porosità e pori di ridotte dimensioni per garantire un’adeguata gestione degli essudati e prevenire l’invasione della ferita da parte dei microrganismi. In questo lavoro di tesi, matrici di nanofibre (NF) di chitosano (CS) contenenti argento (Ag) sono state prodotte partendo da soluzioni contenenti Ag in un rapporto di massa (200:1). Polietilenossido (PEO) è stato aggiunto alla soluzione in piccola percentuale, in modo da facilitare l’elettrofilatura promuovendo la reticolazione delle catene polimeriche. E’ stata osservata la morfologia delle fibre tramite microscopia elettronica a scansione (SEM). Le matrici di NF sono state sottoposte ad irradiazione UV per indurre la formazione delle Ag NP. Sono stati valutati gli effetti causati dall’esposizione alla luce ambientale sulla soluzione utilizzata per la produzione delle matrici di NF attraverso spettrofotometria UV-visibile. Attraverso questa tecnica è stato inoltre possibile valutare la produzione di Ag NP in film polimerici. Questi film sono stati prodotti utilizzando la soluzione usata per la generazione delle matrici di NF e irradiati con UV dopo evaporazione del solvente. Un picco, associato con la risonanza plasmonica di superficie (SPR) delle Ag NP, appare a 430 nm. La sua intensità aumenta con l’aumentare del tempo di irradiazione. Il rilascio di Ag NP in acqua a partire dal film di CS è indicato dalla presenza di un piccolo picco a 430 nm nello spettro UV-visible del lisciviato. Sono state condotte analisi microbiologiche per valutare l’effetto antibatterico delle matrici di NF nei confronti di Staphylococcus aureus, batterio Gram-positivo causa comune di infezioni cutanee. Le matrici di NF di CS/PEO sono state confrontate con matrici di NF di polivinilpirrolidone (PVP), per valutarne le possibili differenze in efficacia. In particolare, sono stati svolti esperimenti per determinare la minima concentrazione inibitoria (MIC) e test di Kirby-Bauer per determinare la suscettibilità dell’agente patogeno verso le matrici di NF. E’ stato osservato che sia le matrici di NF di CS/PEO e di PVP esercitano un effetto batteriostatico su S. aureus, in quanto, in assenza di matrice, le cellule, dapprima inibite dalla presenza della matrice contenente Ag NP, tornano a moltiplicarsi, risultando in una torbidità del mezzo liquido di coltura. E’ ipotizzabile che l’inibizione della crescita cellulare sia dovuta all’effetto delle Ag NP. Difatti, il mezzo di coltura contenente matrice coniugata con Ag NP appare limpido, mentre il mezzo appare torbido se contenente matrice non coniugata con Ag. Il test di Kirby-Bauer ha consentito di notare che sia le matrici di CS/PEO che di PVP coniugate con Ag NP sono in grado di inibire la crescita batterica su terreno solido. Sembra che le matrici di CS/PEO con Ag siano più efficaci rispetto alle matrici di PVP con Ag. E’stata inoltre osservata una leggera inibizione della crescita batterica causata dalle matrici di CS/PEO prive di Ag. Invece, le matrici di PVP prive di Ag NP non sono in grado di bloccare la proliferazione su agar, il che può indicare che le Ag NP siano l’agente fondamentale per indurre un arresto della crescita cellulare.
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Abstract
Nanometric materials are object of great interest in research in biotechnology due to their particular properties. Their dimension, which fall in the range of 1 to 100 nm, are similar to the biomacromolecules such as DNA and proteins. Their large surface area to volume ratio promotes the interactions with living cells. Silver nanoparticles (Ag NPs) emerged as good candidates to confer antimicrobial activity to skin substitutes protecting wounds against infections. Electrospun nanofibers’ mats are particularly apt for this application. Using the electrospinning technique, it is possible to obtain nanofiber (NF) mats composed of polymers conjugated with antimicrobial agents of nanometric dimensions. These mats have high porosity and pores of small size, which are important characteristics in a wound dressing in order to ensure an adequate management of the exudates and to prevent the invasion of the wound by microorganisms. In this research, chitosan (CS) NF mats containing silver (Ag) were produced from solutions containing a weight ratio of 200:1. Poly(ethylene oxide) (PEO) was added in a small percentage to the solution in order to facilitate electrospinning by promoting the entanglement of polymeric chains. Fiber morphology was observed by scanning electron microscopy (SEM). NF mats were irradiated by UV light to induce Ag NPs formation. The effects caused by ambient light on the polymeric solution, which was used for the NF mats production, has been assessed by UV-Vis spectrophotometry. This technique was also used to study the presence of Ag NPs in polymeric films. These films were produced by solvent casting the solution used to electrospin the fibrous mats and irradiated under UV light after solvent evaporation. A peak, associated with the Plasmon resonance of Ag NPs, appeared at around 430 nm. Its intensity increased with an increase in irradiation time. The release of Ag NPs to water from the CS films was also suggested by the presence of a small peak at 430 nm in the UV-vis spectrum of the lixiviate. Microbiological tests have been carried out in order to evaluate the antibacterial effects of NF mats against S. aureus, a Gram-positive bacteria that commonly causes skin infections. Then, the mats of CS/PEO have been compared with mats of poly(vinyl pyrrolidone), with the aim to study the possible difference in efficacy against S. aureus. Particularly, experimental tests have been conducted to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and the Kirby-Bauer test to determine the susceptibility of the pathogen agent towards the nanofibrous mats. It has been observed that both mats of CS/PEO blend and PVP show a bacteriostatic effect against S. aureus because, in the absence of the matrix, the cells start to multiplicate again. In this way, the result is a turbidity observed in the culture liquid medium. It is possible to suppose that the cellular growth inhibition is due to Ag NPs effects. In fact, the culture medium containing the Ag NPs conjugated-matrix appears clear, while it appears turbid if it contains matrix non conjugated with Ag. Ag NPs could induce genetic mutations or causing cell damages. As a consequence, an inhibition of bacterial growth can be obtained. The Kirby-Bauer test lets us note that both Ag NPs conjugated-mats of CS/PEO and PVP are able to inhibit the bacterial proliferation on a solid medium. Ag NP conjugated-mats of CS/PEO seem to be more effective against S. aureus than the PVP ones. It has been observed that CS/PEO mats without Ag NPs are able to inhibit in a slight way the bacterial proliferation. Moreover, the PVP mats without Ag NPs are not able to block the cell growth on agar. This fact can indicate that the Ag NPs are the fundamental agent to stop the cell proliferation.
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