Riassunto analitico
The current experimental thesis, carried out at the FOCAS Research Institute, part of the Technological University Dublin, is aimed at studying the oxidation of fatty acids in vitro through label-free methods.
The oxidation of fatty acids is a fundamental biochemical process for the cell, capable of generating the energy it needs in the form of ATP. (1, 2) The subcellular site where the reactions responsible for this transformation take place is the mitochondrion. (1) The cellular model chosen was that of HepG2 cells, which being very rich in mitochondria, lend themselves very well to our purpose. (75) The interest raised in the analysis of fatty acid oxidation is basically related to its implication in several diseases, such as diabetes with related complications, and cancer.
Its regulation can occur through the modulation of CPT1A, an enzyme complex, since it is the enzyme that catalyzes the limiting reaction of fatty acid oxidation. Hence the need to find methods capable of evaluation at the subcellular level of the mechanism of action of the various FAO modulators in a simple and economics way, without recurring to radioisotope labeling methods.
The instrumental label-free measurement techniques applied are the fluorometer, which exploits fluorescence, and the Raman microspectrometer, which exploits the Raman phenomenon that develops following the interaction of the sample under analysis with a monochromatic radiation. The application of the fluorimetric technique will evaluate the extracellular oxygen consumption rate (OCR) by the cells that is related to the oxidation of fatty acids, using 2 kits: Extracellular O2 Consumption Assay (ab197243) and Fatty Acid Oxidation Assay (ab217602).
Thereafter, by varying the time of inoculation of fatty acids in the cell culture medium, different subcellular areas were measured – cytoplasm and nucleus - using the Raman microspectrometer that combines the Raman spectroscopic technique with an optical microscope. The application of Raman spectroscopy to the study of fatty acids was suggested by their intrinsic chemical structure, in fact their long carbon chain, when irradiated by IR light, vibrating provides characteristic bands. The results obtained were reprocessed and analyzed with Excel and MATLAB by exploiting chemometrics, in particular Partial Least Square and Principal Component Analysis.
The results support further investigation of Raman microspectrometer as a potential label-free technique to evaluate Fatty Acid Oxidation in vitro.
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Abstract
L'attuale tesi sperimentale, svolta presso il FOCAS Research Institute, parte della Technological University di Dublino, è volta a studiare l'ossidazione degli acidi grassi in vitro attraverso metodi label-free.
L'ossidazione degli acidi grassi è un processo biochimico fondamentale per la cellula, capace di generare l'energia necessaria sotto forma di ATP. (1, 2) Il sito subcellulare dove avvengono le reazioni responsabili di questa trasformazione è il mitocondrio. (1) Il modello cellulare scelto è stato quello delle cellule HepG2, che essendo molto ricche di mitocondri, si prestano molto bene al nostro scopo. (75) L'interesse suscitato dall'analisi dell'ossidazione degli acidi grassi è fondamentalmente legato alla sua implicazione in diverse malattie, come il diabete con le relative complicazioni, e il cancro.
La sua regolazione può avvenire attraverso la modulazione di CPT1A, un complesso enzimatico, poiché è l'enzima che catalizza la reazione limitante dell'ossidazione degli acidi grassi. Da qui la necessità di trovare metodi in grado di valutare a livello subcellulare il meccanismo d'azione dei vari modulatori della FAO in modo semplice ed economico, senza ricorrere a metodi di etichettatura con radioisotopi.
Le tecniche strumentali di misurazione label-free applicate sono il fluorimetro, che sfrutta la fluorescenza, e il microspettrometro Raman, che sfrutta il fenomeno Raman che si sviluppa in seguito all'interazione del campione in analisi con una radiazione monocromatica. L'applicazione della tecnica fluorimetrica valuterà il tasso di consumo extracellulare di ossigeno (OCR) da parte delle cellule che è legato all'ossidazione degli acidi grassi, utilizzando 2 kit: Extracellular O2 Consumption Assay (ab197243) e Fatty Acid Oxidation Assay (ab217602).
In seguito, variando il tempo di inoculazione degli acidi grassi nel mezzo di coltura cellulare, sono state misurate diverse aree subcellulari - citoplasma e nucleo - utilizzando il microspettrometro Raman che combina la tecnica spettroscopica Raman con un microscopio ottico. L'applicazione della spettroscopia Raman allo studio degli acidi grassi è stata suggerita dalla loro struttura chimica intrinseca, infatti la loro lunga catena di carbonio, quando irradiata dalla luce IR, vibrando fornisce bande caratteristiche. I risultati ottenuti sono stati rielaborati e analizzati con Excel e MATLAB sfruttando la chemiometria, in particolare Partial Least Square e Principal Component Analysis.
I risultati supportano ulteriori indagini del microspettrometro Raman come potenziale tecnica label-free per valutare l'ossidazione degli acidi grassi in vitro.
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