Riassunto analitico
Le istone deacetilasi (HDACs) sono una famiglia di diciotto enzimi che catalizzano la deacetilazione di proteine istoniche coinvolte nella regolazione dell’espressione genica. Le HDACs sono anche coinvolte nella deacetilazione di alcune proteine non istoniche, che regolano diverse vie biologiche come la trasduzione del segnale, la crescita e la morte cellulare, rendendo questi enzimi un importante bersaglio molecolare per il trattamento del cancro. Sebbene in letteratura siano presenti più di ottomila inibitori di HDAC (HDACi), al presente solo quattro composti sono stati approvati dalla FDA per il trattamento del linfoma periferico delle cellule T e del mieloma multiplo. Uno dei principali svantaggi associati all’utilizzo degli HDACi è l'assenza di specificità nei confronti delle diverse isoforme, con conseguenti gravi effetti collaterali. Recentemente, HDAC6 è stata oggetto di particolare interesse in quanto inibitori selettivi di HDAC6 sono stati descritti come meno tossici, con un conseguente miglioramento del profilo di sicurezza. La progettazione di nuovi HDACi è basata sul classico modello farmacoforico che comprende un gruppo chelante lo zinco (ZBG), un dominio di riconoscimento superficiale, noto anche come cap-group, e una porzione definita linker che collega il cap con lo ZBG. Numerosi sono gli studi di relazione struttura attività relativi alle porzioni dello ZBG e del cap-group. Al contrario, mancano studi sistematici relativi ai requisiti strutturali del linker nella modulazione dell’attività e selettività. Con l'obiettivo di colmare questa lacuna, abbiamo progettato e sintetizzato una libreria di piccole molecole, mantenendo fisso lo ZBG (acido idrossamico) ed esplorando diversi linker.
In uno studio precedente, il gruppo di ricerca di cui ho fatto parte, ha sintetizzato e testato su HDAC1 e HDAC6 una serie di acidi idrossammici a struttura 1,3-diossolanica. I dati ottenuti hanno suggerito che linker voluminosi eterociclici sono in grado di indirizzare la selettività verso HDAC1. Come prosecuzione di questo progetto, nel mio lavoro di tesi magistrale, abbiamo esteso l'esplorazione strutturale del linker al fine di identificare nuovi chemotipi in grado di indirizzare la selettività verso HDAC6. In particolare, abbiamo introdotto linker alifatici (emisuccinato), insaturi (alchino), aromatici [fen (tio) ossiacetato] ed eteroaromatici (benzodiossano / ine, benzofurano e benzotriazolo). Inoltre alcuni linker sono stati decorati con due tipologie di cap-group al fine di stabilizzare l’interazione di legame. Sedici nuovi acidi idrossammici sono stati progettati e sintetizzati. E’ attualmente in corso la valutazione dell’attività enzimatica dei composti sintetizzati sugli enzimi purificati HDAC6 e HDAC1 e sui lisati cellulari. I dati ad oggi pervenuti hanno rivelato che l'introduzione di un corto linker alifatico o aromatico favorisce un guadagno di attività nei confronti di HDAC6 (inibizione del 55-75% a 50 μM e inibizione del 75% a 10 μM rispettivamente) senza tuttavia spostare il profilo di selettività verso questa isoforma. Questi risultati sono in accordo con le caratteristiche strutturali dei siti di legame di HDAC1 e HDAC6 in quanto, lo stretto canale di HDAC6, è in grado di accomodare linker piccoli e lineari, rispetto al tunnel più ampio di HDAC1 che può alloggiare linker più voluminosi.
Il pannello completo dei risultati, assistito dai calcoli di docking, ci consentirà di delineare dettagliate relazioni struttura-attività per la progettazione di nuovi inibitori dotati di elevata potenza e selettività.
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Abstract
Histone deacetylases (HDACs) are a family of eighteen enzymes that catalyse the deacetylation of the histone proteins involved in the regulation of gene expression. HDACs are also involved in the deacetylation of some non-histone proteins involved in several biological pathways such as cellular signal transduction, cellular growth, and death, making these enzymes a validated target for cancer chemotherapy. Although more than eight thousand HDAC inhibitors (HDACi) have been reported, at the present, only four have been approved by FDA for the treatment of peripheral T-cell lymphoma and multiple myeloma. Unfortunately, one of the major drawbacks associated with HDACi is the absence of specificity against the different HDAC isoforms, resulting in severe side effects. Recently, HDAC6 has attracted much attention. Selective HDAC6 inhibitors were described to be less toxic, resulting in an improved safety profile. Thus, the research community is more and more enthused to address this class of HDACs by designing selective inhibitors. At the present, the design of new HDACi is based on a classical pharmacophore model comprising a zinc binding group (ZBG) coordinating the catalytic zinc ion, a surface recognition domain, also known as cap, and a linker portion, which accommodates within the enzymatic tunnel connecting the surface-binding domain with the catalytic zinc ion. The influence of the nature of the ZBG and cap-group on isoform selectivity has been widely investigated. However, little is known about the structural requirement of the linker portion in term of affinity and isoform selectivity. With the aim to fill this gap, we designed and synthesized a focused library of small molecules, taking as ZBG the hydroxamic acid and exploring different chemotypes as linker.
In a previous work, a series of 1,3-dioxolane-based hydroxamic acids were prepared and assessed against HDAC1 and HDAC6 isoforms suggesting that bulky aliphatic heterocyclic linkers shifted the selectivity towards HDAC1. As a continuation of this project, in the present master degree work, we extended the structural exploration on the linker portion in order to identify new chemotypes able to address selectivity towards HDAC6. In particular, aliphatic (i.e. emisuccinate), unsaturated (i.e. alkyne), aromatic [i.e. phen(thio)oxyacetate], and heteroaromatic (i.e. benzodioxane/ine, benzofurane and benzotriazole) linkers were investigated. In addition, selected linkers were decorated with fixed cap-groups in order to better stabilize the binding interactions. Sixteen new hydroxamic acids were designed and synthetized. The enzymatic evaluation of the newly compounds on purified HDAC6 and HDAC1 enzymes and cellular lysates is ongoing.
At the present, the data available revealed that the introduction of a short aliphatic or aromatic linker results in a gain of activity against HDAC6 (55-75% inhibition at 50 uM and 75% inhibition at 10 uM, respectively) although not associated with a shift on selectivity towards this isoform. These results are in accordance with the architecture of the HDAC1 and HDAC6 binding sites, since the narrow channel of HDAC6 is able to accommodate smaller and linear linkers, whereas the wider tunnel of HDAC1 is able to host bulkier aliphatic heterocyclic linkers.
The complete panel of results, assisted by docking calculations, will allowed us to delineate a detailed structure activity relationship that will suggest new structural insight in the search for potent and selective HDAC inhibitors.
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