• CD4/CD8
• citochine
• HIV
• iNKT
• TH1

La terapia antiretrovirale altamente efficace (HAART) ha drammaticamente ridotto la mortalità e morbidità nei pazienti con infezione da HIV. I pazienti che rispondono bene alla terapia mostrano una forte diminuzione dei livelli plasmatici del virus, un ripristino a volte completo dei linfociti T CD4, una diminuzione della percentuale di apoptosi (morte cellulare) e dello stato di iperattivazione del sistema immunitario, e raggiungono un’aspettativa di vita simile a quella dei soggetti non infetti. Tuttavia, una percentuale significativa di pazienti in trattamento abbatte la carica virale, ma non riesce a recuperare le funzioni del sistema immunitario, e mantiene un basso livello di linfociti CD4+, con un alterato rapporto tra cellule CD4+ e CD8+.
Il basso rapporto CD4/CD8 è quindi il fattore principale che influisce sulla prognosi e sull’insorgenza degli eventi non-AIDS-relati (Mussini C. et al., Lancet HIV, Marzo 2015). Tali eventi, che comprendono patologie epatiche, cardiovascolari, insufficienza renale e sviluppo di tumori, sono molto severi e diffusi tra questi pazienti. Per questo motivo, ovvero per identificare e monitorare i pazienti più a rischio, la valutazione del rapporto CD4/CD8 sta assumendo un significato clinico sempre maggiore. Analogamente, l’identificazione delle cellule coinvolte nello sbilanciamento di tale rapporto è oggi di estremo interesse.
Le cellule T natural killer invarianti (iNKT) sono linfociti che formano una popolazione particolare di cellule T esercitanti varie funzioni immunoregolatrici tramite la produzione rapida e massiva di un ampio spettro di citochine. Esse rappresentano un sottotipo di cellule NK che esprimono un recettore invariante per le cellule T (Vα24Jα18) e rispondono ad antigeni glicolipidici. Possono essere classificate in differenti sottopopolazioni sulla base dell’espressione del CD4 o del CD8, e ciascuna popolazione produce diversi tipi di citochine pro infiammatorie dopo stimolazione.
In questo studio sono stati studiati un totale di 25 pazienti HIV+ in cui, dopo un anno di terapia, la carica virale era completamente soppressa, e confrontati con 39 controlli sani simili per età e sesso. Tramite citometria a flusso policromatica, sono stati analizzati i diversi fenotipi delle cellule iNKT e la loro polifunzionalità in 12 pazienti HIV+ “non responders” (con basso rapporto CD4/CD8, i.e. <0,5) e in 13 “responders” (rapporto normale/alto, ˃1).
I linfociti del sangue periferico sono stati marcati con anticorpi monoclonali che riconoscono Va24Ja18 TCR, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 o CD161; è stata poi misurata la capacità di produrre fino a quattro diverse citochine dopo stimolazione con PMA e ionomicina.
I pazienti HIV+ sono hanno ripristinato la percentuale totale di cellule iNKT, nonostante le cellule CD161+ siano minori della norma. La percentuale di iNKT CD8+ è maggiore nei pazienti con rapporto CD4/CD8 diminuito, mentre é minore quella delle iNKT CD4+. Le cellule iNKT con fenotipo doppio negativo (DN, i.e. CD4-CD8-) sono diminuite in entrambi i gruppi, così come le cellule DN CD161+.
L’analisi della produzione citochinica da parte delle differenti iNKT ha rivelato come i pazienti con più basso rapporto CD4/CD8 abbiano una più alta percentuale di cellule CD8+ capaci di produrre sia IFN-γ che IFN-γ e TNF-α contemporaneamente.
La presenza di un’alta percentuale di iNKT che producono IFN-γ nei pazienti non responders suggerisce la presenza di un persistente livello di attivazione e riflette quanto accade nell’intero compartimento di cellule T. Il pronunciato profilo Th-1 delle cellule iNKT nei pazienti con basso rapporto CD4/CD8 può quindi contribuire all’inappropriata e persistente attivazione del sistema immunitario in questi soggetti, che contribuisce ad aumentare il loro rischio per eventi maggiori non AIDS relati.

In the last years, the use of highly active, combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically reduced the mortality and morbidity in HIV+ patients. In those patients taking successful cART, the normalization of the CD4/CD8 ratio has a great clinical relevance, since those with low ratio have an increased risk of serious non-AIDS related events and deaths. Thus, CD4/CD8 ratio can be used to identify patients at risk of non-AIDS-related events (Mussini C. et al., Lancet HIV, March 2015). Invariant natural killer T cells (iNKT) are rare innate-like lymphocytes expressing an invariant T cell receptor (Vα24Jα18) and recognizing glycolipidic antigens. They can be classified into different subpopulations on the basis of the expression of CD4 and CD8; each subpopulation rapidly produce different proinflammatory cytokines upon stimulation. We have analyzed iNKT phenotype and polyfunctionality in HIV+ patients with low (<0.5) and high/normal (>1.0) CD4/CD8 ratio after successful cART. We studied 25 HIV+ adults who started cART with CD4/CD8 ratio <0.5 and had undetectable plasma viral load for >1 year. Among them, 12 maintained a ratio <0.5 while 13 reached a ratio >1; 39 age- and sex-matched subjects were healthy controls (CTR). PBMC were stained with mAbs recognizing Vα24Jα18 TCR, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 or CD161. iNKT cells ability to simultaneously produce up to 4 cytokines was measured in 23 HIV+ patients and in 22 CTR. PBMC were stimulated for 4 h with PMA plus ionomycin, then fixed and stained with Live-dead and with mAbs recognizing Vα24Jα18 TCR, CD3, CD4, CD8, IL-17A, TNF-α, IFN-γ, and IL-4. Up to 20 million cells per sample were acquired by two acoustic focusing flow cytometers (Attune for phenotype, Attune NxT for functionality, from Thermo Fisher). HIV+ patients were able to restore the percentage of total iNKT cells, even if the percentage of iNKT expressing CD161 (either bright or dim) was always extremely low. The percentage of iNKT cells expressing CD8 was higher in patients with low CD4/CD8 ratio, while that of CD4+ iNKT cells was lower. Double negative (CD4-CD8-) iNKT cells were lower in both groups of HIV patients, as well as the population of double negative iNKT cells expressing CD161. Double positive (CD4+,CD8+) iNKT cells were lower in both groups of patients. Analysis of cytokine production by different iNKT cell subsets revealed that patients with low CD4/CD8 ratio had a higher percentage of CD8+ iNKT able to produce IFN-γ as well as more CD8+ iNKT cells able to produce simultaneously IFN-γ and TNF-α. Total iNKT cells, which have an effector-memory phenotype, were restored in patients after cART. The presence of a high percentage of IFN-γ producing CD8+ iNKT cells in patients with low CD4/CD8 ratio likely indicates a persistent level of activation also among such cells, and could reflect what happens in the whole T cell compartment. Finally, the pronounced Th-1 pro-inflammatory profile of iNKT cells from patients with low CD4/CD8 ratio could contribute to the inappropriate and persistent immune system activation.