Riassunto analitico
La medicina rigenerativa rappresenta una branca di enorme interesse per la ricerca medico-scientifica. Diversi tipi di cellule staminali sono stati studiati, sulla base delle loro proprietà di proliferazione, auto-rinnovamento e multipotenza. Le cellule staminali adulte costituiscono una categoria di staminali alternative ed eticamente non-controverse rispetto alle staminali embrionali, per questo motivo hanno attratto una particolare attenzione nell’ultimo decennio. Esse sono state identificate ed isolate da diversi tessuti, tra cui la polpa dentale, tessuto connettivo lasso contenuto nella camera pulpare, considerata una valida fonte di cellule staminali adulte sia per l’elevato contenuto di cellule staminali sia per la ridotta invasività delle procedure necessarie per l’isolamento cellulare. Le cellule staminali adulte della polpa dentale (DPSC) sono ottenute tramite ordinarie procedure odontoiatriche. Per questa tipologia di cellule staminali non è stato possibile individuare un singolo marker che le caratterizzi univocamente, infatti le DPSC sono considerate una popolazione mista. Lo scopo della tesi è di caratterizzare e confrontare due sottopopolazioni di DPSC, sulla base dell’espressione di tre antigeni di superficie: c-Kit, STRO-1, CD34. Le DPSC sono state immuno-selezionate per la doppia positività ai markers c-Kit e STRO-1, dopodichè sono state ricavate due sottopopolazioni, una negativa (CD34-) ed una positiva per CD34 (CD34+). Per entrambe sono stati esaminati l’indice di proliferazione, il mantenimento della staminalità, la senescenza cellulare e la multipotenza. A questo scopo è stata valutata la capacità delle due sottopopolazioni di differenziare nei tre lineages mesodermici: osteogenico, adipogenico, miogenico. Inoltre per entrambe le frazioni cellulari è stata esaminata la capacità differenziativa in senso neurogenico. Da questo studio è emerso che le due sottopopolazioni risultano effettivamente distinte e differenti. Mentre le DPSC CD34- mostrano una capacità proliferativa ed un tempo di duplicazione cellulare costanti nel tempo e il mantenimento dell’espressione dei markers, le DPSC CD34+ mostrano una proliferazione più lenta e limitata nel tempo; inoltre, queste ultime mostrano una precoce e marcata induzione alla senescenza ed una riduzione dell’espressione dei markers nel tempo. Le DPSC CD34- e le DPSC CD34+ sono in grado di differenziare verso i tre lineages mesodermici mostrando l’espressione di markers tipici, tuttavia una differenza significativa si osserva nell’induzione al commitment neurogenico: rispetto alle DPSC CD34- la percentuale di DPSC CD34+ positive alla βIII-tubulina (marker neuronale) è molto elevata. Nel corso del nostro studio è emerso inoltre che le DPSC CD34- indifferenziate non mostrano l’espressione dei markers neurali, CD271 e nestina, mentre le DPSC CD34+ mostrano una netta espressione di entrambi i markers. Questi risultati suggeriscono che le DPSC c-Kit+/STRO-1+/CD34- e le DPSC c-Kit+/STRO-1+/CD34+ possano rappresentare due popolazioni ben distinte di cellule staminali adulte con proprietà proliferative e differenziative differenti, in quanto le prime mostrano una più diretta propensione al differenziamento verso i principali derivati mesodermici mentre le seconde hanno una più spiccata tendenza all’espressione della βIII-tubulina in seguito al commitment neuronale. Questo aspetto potrebbe essere riconducibile alla diversa derivazione embrionale delle cellule della polpa dentale. Infatti, come è ben noto dalla letteratura, queste cellule staminali possono essere di derivazione sia mesodermica sia neuroectodermica. I risultati ottenuti aprono la strada ad ulteriori analisi volte ad approfondire la possibilità che più di una popolazione staminale risieda all’interno della polpa dentale, e definire maggiormente la versatilità applicativa delle cellule staminali da essa derivate per l’uso nella medicina rigenerativa.
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Abstract
Regenerative medicine represents a particularly interesting area of interest for medical-scientific research. Currently, several different types of stem cells have been investigated, according to their properties of proliferation, self-renewal and multipotency. Adult stem cells are considered a non-controversial alternative source of stem cells compared to embryonic stem cells, therefore they have attracted much interest in the last decades. They have been identified and isolated from different tissues, among which dental pulp, a soft connective tissue contained within the tooth crown, is considered a suitable source of adult stem cells either for the high content of cells and for the low invasive procedures required for cell isolation. Adult stem cells derived from dental pulp (DPSCs) can be obtained during routine tooth extraction. DPSCs cannot be identified by a single unique cell surface marker, hence they are considered a mixed and heterogenous cell population. The aim of this thesis is to characterize and compare two subpopulations of DPSCs, based on the expression of three specific cell surface antigens: c-Kit, STRO-1, CD34. DPSCs have been positively immune-selected for c-Kit and STRO-1 markers, then two subpopulations have been derived, negative (CD34-) and positive (CD34+) for CD34 expression, respectively. Both the subpopulations were examined in terms of cell proliferation, stemness maintenance, cell senescence and multipotency. For this purpose, the CD34- and CD34+ DPSCs were evaluated for their ability to differentiate towards the mesoderm lineages: osteogenic, adipogenic, myogenic. Moreover, the capability to commit towards the neurogenic lineage was investigated, in both the populations. The results shown by this study highlighted that the CD34- and CD34+ are actually two distinct and different subpopulations. The CD34- DPSCs showed both proliferation capacity and population doubling time maintained over culture time combined with a maintained expression of stemness antigens, whereas the CD34+ DPSCs demonstrated a slower proliferation that decreases over the time. The CD34+ subpopulation also presented a early and strong induction towards senescence together with a reduced expression of cell surface markers through the passages. With regard to the differentiation potential, both the two subpopulations are similarly able to differentiate towards the mesoderm lineages (osteogenic, adipogenic, myogenic) showing the expression of specific markers, however, a significant difference was observed after the induction towards the neurogenic commitment: a higher percentage of CD34+ DPSCs expressed βIII-tubulin (neural marker), respect to the CD34- DPSCs. Moreover, it was of interest to observe that undifferentiated CD34- DPSCs did not express CD271 and nestin (markers expressed by neural crest derived cells and by undifferentiated cells of the central nervous system, respectively), whereas CD34+ DPSCs showed the expression of both these markers. These results suggest that c-Kit+/STRO-1+/CD34- DPSCs and c-Kit+/STRO-1+/CD34+ DPSCs might represent two distinct and well defined adult stem cell subpopulations with different proliferation and differentiation properties, indeed, the first ones showed a strong tendency towards the mesoderm commitment (osteogenic, adipogenic, myogenic), whereas the second ones demonstrated a higher βIII-tubulin expression after the neurogenic induction. This aspect may be explained by the differential embryological origin of dental pulp cells. To the best of our knowledge from the literature, stem cells obtained from dental pulp may derive either from mesoderm either from neuroectoderm. The results obtained in this study pave the way for further analyses aimed to deeply investigate the hypothesis that more than a single stem cell population resides within the dental pulp, and better define the flexibility of application of dental pulp derived stem cells for their use in regenerative medicine.
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