Riassunto analitico
INTRODUZIONE La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è caratterizzata da vari meccanismi patogenetici che ne influenzano insorgenza e progressione. Tra questi la disfunzione mitocondriale gioca un ruolo cruciale. I neurosteroidi (NS) sono steroidi endogeni neuroprotettivi prodotti da mitocondri e microsomi, coinvolti in crescita neuronale, mielinizzazione e neuroinfiammazione, un processo che evolve nelle diverse fasi della SLA. Solo due studi sul modello di topi Wobbler hanno riportato una diminuzione dei livelli di progesterone e testosterone rispetto ai topi sani. Questo studio ha lo scopo di analizzare ed analizzare la distribuzione dei livelli di NS nel liquido cerebrospinale (CSF) dei pazienti affetti da SLA rispetto ai controlli sani. MATERIALI E METODI Questo studio monocentrico caso-controllo, ha incluso pazienti affetti da SLA, ricoverati presso l'U.O. di Neurologia di Modena dal 2015 al 2020, sottoposti a puntura lombare (LP) come parte dell’iter diagnostico e avendo a disposizione almeno 0,7 mL di CSF per lo studio. I controlli sono stati ricoverati nella stessa Unità nello stesso periodo per malattia neurologica sospetta e in seguito non confermata, sottoposti a LP e hanno donato il CSF alla Neurobiobanca di Modena. Il sesso, l'età e le comorbidità cliniche sono stati raccolti per tutti i partecipanti; i sintomi, il sito di insorgenza, il genotipo, i tassi di progressione sono stati registrati per i pazienti affetti da SLA. Abbiamo analizzato progesterone, diidroprogesterone, pregnenolone, pregnenolone solfato, allopregnanolone e testosterone utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa-elettrospray. I biomarcatori della neurodegenerazione e della neuroinfiammazione sono stati valutati mediante un test ELISA semi-automatizzato di nuova generazione. Sono stati eseguiti anche esami del sangue. RISULTATI Sono stati arruolati un totale di 37 pazienti (17 F, 20 M; età media al campionamento 52,08±11,56 anni, 8 con esordio bulbare) e 28 controlli (18 F, 10 M; età media al campionamento 49,16±16,71 anni). Il punteggio medio ALSFRS-R, il tasso di progressione, FVC% al campionamento e il tempo di generalizzazione in mesi sono stati rispettivamente 40,97±4,83, 1,57±1,69, 94,82±24,61 e 13,85±13,10. Tra i NS analizzati, è stata trovata una significativa diminuzione di progesterone (p=0,015), pregnenolone (p<0,001), pregnanolone (p<0,001), allopregnanolone (p=0,008) e testosterone (p=0,010) nel CSF dei pazienti affetti da SLA rispetto ai controlli, anche dopo aggiustamento per età e sesso. Questi livelli non variavano tra i pazienti con diverso sito di insorgenza, genotipo o velocità di progressione. Le concentrazioni di neurofilamenti (Nfs) sono aumentate nei pazienti rispetto ai controlli (p<0,001) ed è stata trovata una significativa correlazione negativa tra alcuni NS e i Nfs sia nel CSF che nel siero. All'interno del gruppo SLA, non si è dimostrata una correlazione tra NS e caratteristiche cliniche, demografiche e di progressione di malattia. Non è stato trovato un ruolo dei NS sulla sopravvivenza libera da tracheostomia, che è stata invece influenzata dal rapporto neutrofili/linfociti (HR 1,41,95%CI 1,11-1,80,p=0,005), Nfs leggeri sierici (HR 1,007,95%CI 1,00-1,01,p=0,003) e dalla velocità di progressione al campionamento (HR 4,81,95%CI 1,98-11,66, p=0,001). DISCUSSIONE In questo studio sono stati riscontrati dei livelli di NS complessivamente diminuiti nel CSF dei pazienti affetti da SLA, senza associazione a un determinato sito di insorgenza, caratteristiche cliniche o progressione della malattia. Questo suggerisce una produzione sregolata di NS come fenomeno consistente e generalizzato nella SLA. La correlazione inversa con Nfs, biomarcatori consolidati della neurodegenerazione, potrebbe suggerire che la riduzione di NS possa essere una conseguenza dell'esaurimento di un meccanismo compensatorio per contrastare la neuroinfiammazione.
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Abstract
ABSTRACT
INTRODUCTION
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is characterized by various pathomechanisms affecting its onset and progression, with mitochondrial dysfunction playing a crucial role in both sporadic and familial cases. This dysfunction leads to changes in energy production. Neurosteroids (NS) are neuroprotective endogenous steroids produced by mitochondria and microsomes, involved in neuronal growth, myelination, and the regulation of neuroinflammation, a process that evolves throughout the different phases of ALS up to the terminal stage. Only two studies using the Wobbler mice model have reported decreased levels of progesterone and testosterone compared to healthy mice. This pilot study aims to analyze NS levels in the cerebrospinal fluid (CSF) of ALS patients compared to healthy controls (HC) and examine their distribution across different patient subgroups.
MATERIALS AND METHODS
This single-center case control study, included ALS patients who were admitted to the Neurology Unit of Modena from 2015 to 2020 and underwent lumbar puncture (LP) as part of their diagnostic process, having at least 0.7 mL of CSF available for the study. HC were admitted to the same Unit in the same period for suspected and later unconfirmed neurological disease. They underwent LP for diagnostic purposes and donated their CSF to the Neurobiobank of Modena. Sex, age, and clinical comorbidities were collected for all the participants; clinical features, site of onset, genotype, progression rates were recorded for ALS patients. We analyzed progesterone, dihydroprogesterone, pregnenolone, pregnenolone sulfate, allopregnanolone and testosterone using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Biomarkers of neurodegeneration and neuroinflammation were assessed by a semi-automated next-generation ELISA. Systemic blood tests were also performed.
RESULTS
A total of 37 ALS patients (17 F, 20 M; mean age at sampling 52.08±11.56 yrs, 8 with bulbar onset), and 28 HC (18 F, 10 M; mean age at sampling 49.16±16.71 yrs) were enrolled. Mean ALSFRS-R total score, progression rate, FVC% at sampling, and time to generalization in months were respectively 40.97±4.83, 1.57±1.69, 94.82±24.61 and 13.85±13.10. Among the analysed NS, there was a significant decrease of progesterone (p=0.015), pregnenolone (p<0.001), pregnanolone (p<0.001), allopregnanolone (p=0.008) and testosterone (p=0.010) in the CSF of ALS patients with respect to HC, even after adjusting for age and sex. These concentrations did not vary among patients with different site of onset, genotype, or progression velocity. Neurofilaments (Nfs) concentrations were increased in ALS patients compared to HC (p<0.001), and a significant negative correlation was found between some NS and both CSF and serum Nfs heavy and light. Within the ALS group, we could not demonstrate a consistent correlation between NS and clinical and demographical features, including measures of disease progression. We could not find a role of NS on tracheostomy-free survival, which was instead impacted by neutrophils/lymphocytes ratio (HR 1.41,95%CI 1.11-1.80,p=0.005), serum Nfs light concentration (HR 1.007,95%CI 1.00-1.01,p=0.003) and progression rate at sampling (HR 4.81,95%CI 1.98-11.66, p=0.001).
DISCUSSION
In this pivotal study overall decreased CSF levels of NS were found in ALS patients, without association to a certain site of onset, clinical features, or disease progression. These results suggest a dysregulated production of NS as a consistent and generalized phenomenon in ALS. The inverse correlation with Nfs, established biomarkers of neurodegeneration, might suggest that NS reduction can be a consequence of the exhaustion of a compensatory mechanism to counteract neuroinflammation.
Key words: ALS, neurosteroids, neuroinflammation, neurofilaments, mitochondria
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