Riassunto analitico
La presente tesi sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata nell’ambito del programma Erasmus+ tra il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia e la Facoltà di Scienze Agrarie, Scienze Nutrizionali e Gestione Ambientale dell’Università Justus-Liebig di Gießen con la Prof. Federica Pellati nel ruolo di coordinatrice. L’attività di ricerca sperimentale è stata svolta nei laboratori dell’“Istituto Fraunhofer di Biologia Molecolare ed Ecologia Applicata (IME)”, sotto la supervisione del Prof. Till F. Schäberle e della Dott. Maria A. Patras.
Nel presente lavoro di tesi è stata effettuata una coltivazione ad alta resa di un ceppo appartenente al phylum Acidobacteria, un batterio gram-negativo la cui ubiquità, abbondanza nel suolo e capacità di sopportare ambienti inquinati ed estremi, suggeriscono che esplichi funzioni importanti per l’ambiente.
L’estratto ottenuto è stato studiato nella pipeline di scoperta di composti naturali di interesse farmaceutico, che comprendeva un pannello di screening che ha rilevato un'attività antimicrobica solo contro Septoria tritici. Septoria tritici è una specie di fungo filamentoso appartenente alla famiglia delle Mycosphaerellaceae ed è un agente patogeno della pianta del grano che causa la Septoria Tritici Blotch (STB), una malattia fogliare del grano difficile da controllare a causa dell’elevata resistenza a numerosi fungicidi.
Sulla base dell'attività iniziale dell'estratto grezzo è stato eseguito un micro-frazionamento associato UPLC-HRMS2. Le frazioni ottenute sono state nuovamente analizzate e gli agenti causanti l'attività sono stati dereplicati come putativi derivati di malassezindole e pityriacitrin, mediante il confronto del loro comportamento ad MS ad alta risoluzione e MS/MS con i database dei prodotti naturali commerciali. La dereplicazione è stata integrata dall'analisi del Molecular Networking, volta a valutare la complessità della famiglia strutturale.
L'isolamento dei composti è stato effettuato da un brodo di fermentazione di 31.5 L mediante vari passaggi cromatografici, tra cui matrici Amberlite XAD e RP-C18. L'evoluzione del processo di purificazione è stata monitorata mediante UPLC-MS in tutte le fasi.
Le strutture chimiche dei composti isolati sono state successivamente confermate dall'analisi NMR. In seguito alla verifica strutturale, l'attività biologica dei composti purificati è stata testata contro Septoria tritici per valutarne l'efficacia antimicrobica.
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Abstract
This Experimental Thesis for a Master Degree in Pharmaceutical Chemistry and Technology was carried out within the framework of the Erasmus+ program between the Department of Life Sciences of the University of Modena and Reggio Emilia and the Faculty of Agricultural Sciences, Nutritional Sciences and Environmental Management of the Justus-Liebig University of Gießen, with Prof. Federica Pellati in the role of coordinator. The experimental research activity was carried out in the laboratories of the “Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology (IME),” under the supervision of Prof. Till F. Schäberle and Dr. Maria A. Patras.
In the present thesis project, a high-throughput cultivation was performed on a strain belonging to the phylum Acidobacteria, a gram-negative bacteria whose ubiquity, abundance in soil and ability to withstand polluted and extreme environments suggest that it plays relevant environmental roles.
The extract obtained was investigated in the natural product drug discovery pipeline, which included a screening panel that revealed antimicrobial activity only against Septoria tritici. Septoria tritici is a species of filamentous fungus belonging to the Mycosphaerellaceae family and it is a wheat plant pathogen that causes Septoria tritici blotch (STB), a foliar disease of wheat that is difficult to control due to high resistance to many fungicides.
Based on the initial crude extract activity a UPLC-HRMS2-associated micro-fractionation was performed. The resulting fractions were re-tested and the activity causing agents were dereplicated as putative malassezindole and pityriacitrin derivatives, by comparison of their high-resolution MS and MS/MS behavior with commercial natural products databases. Dereplication was complemented by Molecular Networking analysis, meant to assess the complexity of the structural family.
Isolation of the compounds was performed from a 31.5 L fermentation broth by various steps of chromatography including Amberlite XAD and RP-C18 matrices. Evolution of the purification process was monitored by UPLC-MS at all stages.
The chemical structures of the isolated compounds were subsequently confirmed by NMR analysis. Following structural verification, the biological activity of the purified compounds was tested against Septoria tritici to evaluate their antimicrobial efficacy.
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