Riassunto analitico
La presente tesi sperimentale, svolta presso il Laboratorio di Tossicologia Veterinaria di UNIRELAB, ha come scopo lo sviluppo e la validazione di un metodo analitico volto a valutare la presenza o assenza di bifosfonati in plasma di cavallo. La presente ricerca si concentra sull’identificazione di otto molecole appartenenti a tale classe e nello specifico: Clodronato, Tiludronato, Zoledronato, Alendronato, Etidronato, Incadronato, Ibandronato, Risedronato.
Il metodo prevede il pretrattamento del campione, l’estrazione in fase solida (SPE), la derivatizzazione, ed infine l’analisi tramite Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione (HPLC) accoppiata alla Spettrometria di Massa ad Alta Risoluzione (HRMS) utilizzando lo spettrometro di massa Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ della Thermo ScientificTM, con sorgente di Ionizzazione per Elettronebulizzazione ESI ed analizzatore Orbitrap. Lo spettrometro è stato utilizzato in due modalità d’acquisizione: Fullscan, per le analisi di screening, e PRM, per quelle di conferma.
Ultimato lo sviluppo del metodo, è stata eseguita la validazione attraverso la valutazione di parametri quali selettività, limite di rivelazione (LOD), linearità, ripetibilità e recovery. I risultati finali ottenuti soddisfano i criteri d’accettazione adottati:
- Il metodo di prova è selettivo per i bifosfonati;
- Il LOD del metodo è pari a 0.1 ng/mL per Tiludronato e Incadronato; 1 ng/mL per Clodronato, Zoledronato, Alendronato, Etidronato, Ibandronato; 10 ng/mL per Risedronato;
- La linearità è soddisfatta nel campo di misura 0.1-125 ng/mL per Tiludronato, 0.1-125 ng/mL per Clodronato e 5-125 ng/mL per Zoledronato;
- Il metodo risulta ripetibile, il limite di ripetibilità r < 0.4 minuti rispetta i criteri AORC;
- Il recovery risulta in un intervallo 20-100%, quindi l’estrazione degli analiti dalla matrice è efficiente, con percentuali più elevate per i bifosfonati totalmente derivatizzati.
Le prestazioni del metodo analitico sono state verificate mediante prova d’analisi su campioni di plasma provenienti da circuiti internazionali. Dal riesame dei risultati si evidenzia che le positività riscontrate in tre campioni su quattro soddisfano pienamente il protocollo per questo test sui bifosfonati.
In conclusione, gli esiti per questo progetto di tesi hanno dato evidenza sperimentale sulle reali capacità del metodo analitico; il metodo di prova validato si dimostra attendibile e performante e risulta idoneo all’identificazione dei bifosfonati in plasma di cavallo con tecnica LC-HRMS.
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