Riassunto analitico
La ricerca condotta nel periodo di tesi sperimentale presso OPOCRIN, nasce dall’esigenza della ditta di validare un metodo idoneo alla determinazione dell’attività fibrinolitica in vitro di un farmaco in sviluppo (OP) simile al DEFIBROTIDE (miscela di polidesossiribonucleotidi estratti da tessuti di mammifero con azione antitrombotica e fibrinolitica).
Per prima cosa, attraverso una sostenuta ricerca bibliografica è stato selezionato il metodo da ottimizzare, individuato come procedura descritta nel brevetto US 9,902,952. Il metodo si basa sul meccanismo d’azione attribuito al defibrotide, ovvero l’attivazione della plasmina, quale enzima pro-fibrinolitico.
In breve, dal plasma viene precipitata la frazione EUGLOBULINICA (contenente vari fattori pro-fibrinolitici ma povera di inibitori della fibrinolisi) che, posta a contatto con DEFIBROTIDE, o altra miscela di acidi nucleici, si attiva. L’attivazione, direttamente proporzionale alla quantità di DEFIBROTIDE, viene misurata sulla base della quantità di p-nitroanilina (p-NA) che viene prodotta dalla reazione con un substrato cromogeno specifico per la plasmina. Attraverso misure spettrofotometriche si determina la concentrazione di p-NA, e, seguendo le cinetiche di reazione, l’attività fibrinolitica.
La fase sperimentale ha portato inizialmente a testare il prodotto OP rispetto al farmaco, così da garantire l’applicabilità del metodo anche al campione in sviluppo in Opocrin.
Quindi, dalle prove eseguite nella fase di PRECONVALIDA è stato elaborato un Protocollo di Convalida all’interno del quale sono stati stabiliti i parametri da convalidare e i criteri statistici richiesti per l’accettazione del dosaggio. Sono stati studiati la linearità, il range operativo, la robustezza, la specificità e la precisione del metodo.
La convalida del metodo è stata effettuata su Defitelio (defibrotide), un Orfan Drug commercializzato dalla Ditta GENTIUM S.p.A per il trattamento della malattia veno-occlusiva epatica o “Hepatic Veno Occlusive Disease”, che si manifesta in seguito a chemioterapia antecedente a trapianto di midollo osseo, a livello dei sinusoidi epatici. In particolare in questa fase sono stati analizzati due lotti diversi di Defitelio in commercio, considerato a 30 U/mg.
I risultati ottenuti sono stati analizzati grazie al modello “Parallel line model” applicato dal Software di calcolo, fornito dalla EDQM, “COMBISTATS”, come indicato in Farmacopea Europea. Dall’elaborazione dei dati forniti da COMBISTATS, un foglio di calcolo certificato, si è ricavato il VALORE DI ATTIVITÀ FINALE del campione rispetto al valore dello standard. Esso permette ci accertare l’affidabilità dei risultati di ogni singola prova sulla base di test statistici, che consistono nell’analisi della varianza, ANOVA. I diversi criteri da soddisfare per l’analisi di varianza sono stati verificati e rispettati per ogni singolo dosaggio indicando la bontà ed applicabilità nelle prove di routine del metodo scelto per l’analisi dell’attività fibrinolitica del DEFITELIO.
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