Riassunto analitico
Le piante medicinali rappresentano da sempre una fonte importante di molecole bioattive di interesse chimico farmaceutico. Recentemente le tecniche di ingegneria genetica hanno aperto la possibilità di estendere la varietà di molecole di interesse farmacologico prodotte dalle piante. In questo contesto, Nicotiana tabacum L., comunemente nota come pianta del tabacco, è stata molto studiata come bioreattore per la produzione di metaboliti secondari appartenenti ad altre specie vegetali, proteine e vaccini.
Il presente progetto di tesi sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche ha avuto l’obiettivo di investigare per la prima volta la produzione di cannabinoidi (e di loro precursori biosintetici) da piante di N. tabacum transgeniche, geneticamente modificate dalla Dott.ssa Stacey Kerr del gruppo di ricerca del Prof. Paul McCabe, presso la University College Dublin, School of Biology and Environmental Science, Dublin, Ireland.
A tale fine è stata condotta una analisi qualitativa per la ricerca di cannabinoidi e loro precursori biosintetici in 55 campioni di foglie di N. tabacum transgeniche, trasfettate con geni che codificano per la biosintesi dei cannabinoidi, dei quali è stata confermata la presenza mediante analisi PCR. Le analisi sono state focalizzate su acido cannabigerolico (CBGA), acido ∆9-tetraidrocannabinolico (∆9-THCA), acido cannabidiolico (CBDA) e acido olivetolico, loro precursore nella via biosintetica. Oltre ai cannabinoidi acidi, sono stati analizzati anche i relativi composti ottenuti dalla decarbossilazione, quali cannabigenolo (CBG), ∆9-tetraidrocannabinolo (∆9-THC), cannabidiolo (CBD) e olivetolo. E’ stato inoltre aggiunto al pool degli analiti target il cannabinolo (CBN), che rappresenta il principale prodotto di degradazione ∆9-THC.
Per fare ciò è stato prima di tutto necessario estrarre il materiale vegetale di partenza mediante una macerazione dinamica con etanolo, precedentemente ottimizzata presso il laboratorio di ricerca della Prof.ssa Federica Pellati, che consente di estrarre i cannabinoidi acid e neutri. Il primo screening analitico sugli estratti è stato eseguito tramite TLC su silice con l’ausilio del reattivo cromatico Fast Blue B, specifico per la rivelazione dei cannabinoidi. Questa analisi investigativa iniziale ha mostrato una modesta positività in alcuni campioni, seppur non fornendo risultati apprezzabili.
Successivamente, l’analisi dei composti di interesse e dei loro precursori è stata condotta mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. L’uso di tecniche analitiche all’avanguardia ha permesso di ottenere un profilo qualitativo dei cannabinoidi espressi più dettagliato e accurato.
Un primo risultato è stato ottenuto mediante la tecnica HPLC-UV/DAD-ESI-MSn (con analizzatore a trappola ionica), che ha evidenziato la presenza di cannabinoidi in una parte dei campioni analizzati. Sono state sfruttate le considerevoli potenzialità in termini di sensibilità di un sistema UHPLC-HRMS che, tramite l’uso di un analizzatore di massa Q-Exactive Orbitrap, ha permesso di constatare la presenza di cannabinoidi nella maggioranza dei campioni presi in esame.
Questo studio ha consentito di evidenziare come, utilizzando tecniche analitiche via via più sensibili, sia stato possibile confermare la presenza dei cannabinoidi in piante di N. tabacum transgeniche utilizzate come bioreattori. In futuro, si procederà all’analisi dei campioni in UHPLC-HMRS nella modalità Selected Ion Monitoring (SIM), in modo da ottenere una quantificazione completa dei cannabinoidi rilevati.
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