• biodistribution
• detection protocol
• extraction
• HPLC
• nanoparticles

Il trattamento delle malattie neurologiche rappresenta una delle sfide più complesse in clinica a causa dell’inabilità di farmaci potenzialmente efficaci di attraversare la barriera ematoencefalica (BEE), il principale sistema di difesa costruito attorno al sistema nervoso centrale (SNC). Il gruppo Te.Far.T.I. dell’Università di Modena e Reggio Emilia, con cui ho collaborato per la realizzazione del mio lavoro di tesi sperimentale, è da anni impegnato nello sviluppo di approcci innovativi nel trattamento di malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Huntington, un disordine ereditario ancora senza cura i cui sintomi cognitivi e motori sono stati collegati a una riduzione dei livelli celebrali di colesterolo. Essendo il colesterolo incapace di attraversare la BEE, risulta indispensabile formularlo in un drug delivery system (DDS) che gli permetta di raggiungere il SNC in concentrazioni efficaci. Tra tutti i nanovettori resi disponibili grazie agli avanzamenti delle nanotecnologie applicate in campo medico, ci si è focalizzati sullo sviluppo di nanoparticelle (NPs), in particolare nanoparticelle lipidiche interamente costituite da colesterolo, con il duplice ruolo di componente strutturale e principio attivo, e ingegnerizzate per il superamento della BEE. Uno degli aspetti principali da valutare nello sviluppo di un nanocarrier è la sua biodistribuzione in seguito a somministrazione sistemica al fine di verificare la sua capacità di eludere i sistemi di difesa fisiologici e raggiungere il sito target.
Pertanto, il mio lavoro di tesi è stato principalmente incentrato sulla messa a punto e ottimizzazione di un metodo per valutare la biodistribuzione di nanoparticelle di colesterolo direzionate al cervello, aspetto non ancora esaminato. In particolare, l’obiettivo è stato quello di mettere a punto un metodo adatto ad estrarre dai tessuti biologici (omogeneizzazione e estrazione solido-liquido) e quantificare (HPLC) il colesterolo-Cy5, aggiunto nelle formulazioni nanoparticellari per tracciare la loro distribuzione e per distinguere il colesterolo apportato tramite le NPs da quello endogeno. Il metodo di estrazione è stato validato lavorando su organi ottenuti da topi non trattati, iniettati poi ex-vivo con quantità note di colesterolo-Cy5. Sono state indagate diverse variabili operative (tipo e volume di solvente estraente, tempo di contatto, tecniche meccaniche) al fine di ottenere la migliore resa estrattiva. Il metodo ottimizzato è stato poi applicato su tessuti ottenuti da topi non trattati e iniettati ex-vivo con NPs di colesterolo-Cy5.
In parallelo, sono state poste le basi per un metodo di estrazione e quantificazione (fluorimetria) del PLGA-Cy5, con la prospettiva futura di confrontare la biodistribuzione di nanoparticelle lipidiche e polimeriche.
In merito al colesterolo-Cy5, il metodo di estrazione ottimizzato ha reso possibile un recupero prossimo al 100%, sia dal tessuto iniettato con colesterolo-Cy5 libero che con colesterolo-Cy5 NPs, dimostrando la sua abilità nel disaggregare le nanoparticelle e estrarre l’analita di interesse. Inoltre, sono stati ottenuti risultati comparabili da tutti i diversi tipi di tessuti analizzati (cervello, fegato, milza, rene, polmone), rendendo questo metodo adatto per studi di biodistribuzione in vivo, le cui prime prove sono attualmente in corso.
Relativamente al PLGA-Cy5, il metodo di estrazione applicato a PLGA-Cy5 NPs ha permesso un recupero prossimo all’80% con molta variabilità tra i campioni rendendo necessaria un’ulteriore ottimizzazione, attualmente in corso, al fine di ottenere una resa costante e completa prima dell’applicazione in un futuro studio in vivo.

The treatment of neurological disorders is one of the most challenging tasks in clinics due to the inability of many potential drugs to cross the Blood-Brain Barrier (BBB), the main defensive system built around Central Nervous System (CNS). The Te.Far.T.I. group at the University of Modena and Reggio Emilia, with whom I have collaborated to carry out my thesis work, has been concerned over the years with the development of innovative approaches in the treatment of neurodegenerative disorders, among which Huntington’s disease (HD), an inherited disease still uncurable whose motor and cognitive impairments have been related to reduced brain cholesterol levels. Because of cholesterol’s inability to cross the BBB, a drug delivery system (DDS) enabling cholesterol to reach the CNS in effective concentrations must be designed. Among all the nanocarriers which come from the advances in the field of nanotechnology, this work was focused on the formulation of nanoparticles (NPs), in particular lipid NPs entirely made of cholesterol, being both a structural component and the active agent, and surface modified with ligands recognized by the receptors on the BBB. When developing a new nanocarrier, one of the main concerns is to investigate its biodistribution after in vivo administration, assessing its ability to escape body clearance systems and reach the targeted site. Therefore, the main aim of this work carried out for my experimental thesis was to set up and optimize a method which would be applied to examine the biodistribution of brain-targeted cholesterol NPs, which has not yet been investigated. In particular, we have been engaged in developing a method able to extract from biological tissues (homogenization followed by solid-liquid extraction) and quantify (HPLC analysis) cholesterol-Cy5, which was formulated into NPs’ to track their trafficking and to distinguish the amount of cholesterol delivered via NPs from the endogenous pool. The method was optimized working on tissues obtained from untreated mice, which were then spiked ex-vivo with known quantities of free cholesterol-Cy5. Several operating variables were investigated (i.e. type and volume of extractive solvent, time of contact, mechanical handling) aiming to reach the highest recovery yield. The optimized method was finally applied on tissues obtained from untreated mice and then injected ex-vivo with cholesterol-Cy5 NPs. Furthermore, we laid the background for another extraction and quantification method (fluorimetry) of PLGA-Cy5 with the perspective to compare the biodistribution of cholesterol and polymeric NPs in future studies. As for cholesterol-Cy5, the optimized extraction method enabled a recovery yield close to 100%, both on tissues injected with free cholesterol-Cy5 and with cholesterol-Cy5 NPs, demonstrating its ability to disaggregate the NPs and to extract the analyte of interest. It also provided comparable results with all the different types of tissues analysed (i.e. brain, liver, spleen, kidney, lung), making this method suitable for in vivo studies, the first trials of which are currently being carried out. As for PLGA-Cy5, the extraction method allowed a recovery of around 80% with too much variability between samples thus requiring further optimizations, which are currently in progress, to reach a consistent and complete recovery yield before applying it in the future for in vivo studies.