Riassunto analitico
In questi ultimi anni lo sviluppo di nanosistemi lipidici biocompatibili sta registrando un notevole interesse, soprattutto per il trattamento di patologie tumorali. In particolare i liposomi, vescicole costituite da fosfolipidi e colesterolo, dotati di ampia versatilità formulativa in quanto capaci di incorporare farmaci idrofobi e idrofili nel loro “core” acquoso, sono ampiamente studiati e inseriti in trial clinici e nella normale pratica terapeutica per il trattamento di varie forme tumorali. Per il trattamento del carcinoma ovarico, in cui si registra l'instaurarsi di una precoce farmacoresistenza (soprattutto al cis-platino) dovuta, tra l’altro, ad una over-espressione degli enzimi del ciclo dei folati, tra i quali la Timidilato Sintasi (hTS), recentemente sono stati sintetizzati composti octapeptidici (come il peptide LR) in grado di inibire hTS. La veicolazione di questi peptidi mediante liposomi, oltre a permettere un targeting passivo al tessuto tumorale, può consentire il raggiungimento del target intracellulare, difficilmente raggiungibile dai peptidi a causa della loro elevata idrofilia e dalla loro incapacità di diffondere spontaneamente all'interno delle cellule. Lo scopo di questo progetto di tesi è stato pertanto quello di formulare e caratterizzare diversi sistemi liposomiali per la veicolazione del peptide LR. Nello specifico è stato valutato approfonditamente se il rilascio intracellulare, innescato da uno stimolo, del composto incapsulato consente di ottenere una maggiore efficienza di delivery e quindi una maggiore efficacia del farmaco trasportato. A questo scopo sono stati formulati e caratterizzati quattro sistemi liposomiali, formulati con una differente composizione fosfolipidica: (i) PC:C ovvero liposomi convenzionali costituiti da fosfatidilcolina e colesterolo; (ii) DOPE:CHEMS, liposomi costituiti di dioleil fosfatidiletanolammina e colesterolo emisuccinato; (iii) DOPE: CHEMS:DSPE, liposomi simili ai precedenti ma con in più la distearoilfosfotetanolamina; (iv) DOPE:CHEMS:DSPE_PEG-2000 liposomi simili ai precedenti ma PEGilati. Tutte le formulazioni, eccetto i liposomi PC:C convenzionali, sono pH sensibili cioè in grado di modulare il rilascio del composto incapsulato in funzione del pH circostante. I sistemi di delivery sono stati confrontati sul piano chimico-fisico riguardo morfologia, dimensione, omogeneità dimensionale, carica superficiale e pH sensibilità. Inoltre, è stata valutata la stabilità dimensionale in siero e a lungo termine. Il caricamento del peptide nei sistemi liposomiali è stato analizzato quantitativamente, dopo estrazione dai liposomi, mediante un sistema HPLC accoppiato a spettrometro di massa in triplo quadrupolo (LC-MS/MS). Con lo stesso metodo analitico è stato valutato il rilascio del peptide dai liposomi, a diversi tempi d'incubazione, in tampone fosfato e in tamponi a diversi valori di pH. Infine, sono stati effettuati studi in vitro di citotossicità tramite saggio MTT su linee cellulari di carcinoma ovarico cisplatino-resistenti (cellule C13*), in modo da verificare l'attività del peptide incapsulato e individuare il sistema liposomiale più idoneo alla veicolazione del peptide LR. Le analisi effettuate hanno mostrato come sia possibile caricare il peptide nei vari sistemi liposomiali ottenendo in ogni caso una buona efficienza di incapsulazione. Tuttavia i migliori risultati in termini di efficacia sono stati ottenuti con i liposomi pH sensibili che manifestavano un effetto sulle cellule di carcinoma ovarico cis-platino resistenti già dopo brevi tempi di incubazione, probabilmente grazie ad un rilascio attivo ed effettivo del peptide nel citoplasma cellulare dove il peptide, grazie all’inibizione di hTS, esercita il suo effetto citotossico.
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Abstract
In the last years much attention has been focused on the development of biocompatible lipid nano-systems intended for the treatment of tumor diseases. In particular, liposomes, vesicles made of phospholipids and cholesterol, characterized of high formulation versatility and able to load hydrophobic and hydrophilic drugs, are widely studied and included in clinical trials and in normal therapeutic practice for the treatment of various tumor forms. For the treatment of the ovarian cancer, a tumor characterized by the establishment of an early drug resistance due to several phenomena, including the over-expression of the folate cycle enzymes, such as thymidylate synthase (hTS), recently octapeptidic compounds (i.e. LR peptide) able to inhibit hTS have been synthesized.
The delivery of these peptides by liposomes could achieve a passive targeting to the tumor tissue and the internalization in the tumor cell, which is very difficult to achieve because of the high hydrophilicity of peptides, unable to diffuse spontaneously though the cell membrane. The aim of this thesis project was to develop and characterize several liposome formulations for the delivery of the LR peptide. Besides, it has been evaluated in detail whether the use of a stimuli-responsive release of the encapsulated compound could allow higher delivery effectiveness. For this purpose, several liposomes were characterized and compared. Liposomes differ in phospholipids formulation; in particular the following samples were formulated: (i) PC:C (conventional liposomes) made of phosphatidylcholine and cholesterol, (ii) DOPE: CHEMS liposomes made of dioleoyl-phosphatidyl-ethanolamine and cholesteryl hemisuccinate, (iii) DOPE: CHEMS: DSPE liposomes composed like the previous formulation with distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine phospholipid and (iv) DOPE: CHEMS: DSPE_PEG-2000 liposomes that were PEGylated. The last three formulations were pH sensitive, i.e. able to modulate the release of the encapsulated compound in function of the external pH. The delivery systems were compared on the basis of their physico-chemical properties such as morphology, size, surface charge, homogeneity, and pH sensitivity. Moreover, dimensional long-term stability and in serum stability were evaluated. After extraction from the liposomes, the loading of the peptide was quantified using a HPLC system coupled with triple-quadrupole mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the same analytical method the peptide release from liposomes in phosphate buffer at different incubation times and at different pH values was also analyzed. Finally, in vitro cytotoxicity studies were carried out using MTT assay on cis-platin-resistant ovarian cancer cell line (C13 *), in order to verify the activity of the encapsulated peptide, and evaluate which of the liposomal formulations was the most adequate for an efficient delivery of the peptide. In conclusion the hydrophilic octapeptide was encapsulated achieving a good level of encapsulation efficiency in all the liposomal formulations. In particular, the pH sensitive liposomes showed the highest cell activity even at short incubation time, due to an active and effective release of peptide in the cell cytoplasm, where it was able to inhibit hTS inducing the death of the cis-platinum resistant ovarian cancer cells.
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