Riassunto analitico
Le tecniche di Genome Editing mediate da endonucleasi ingegnerizzate (Engineered EndoNucleases, EENs) permettono la modificazione diretta di una specifica sequenza di DNA. Le nucleasi ingegnerizzate note come Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) sono caratterizzate da un semplice design, alta specificità di sequenza e ridotta tossicità. Le EENs introducono una lesione a doppio filamento in un sito target designato che viene successivamente riparato dai sistemi di riparo cellulari. Normalmente il danno viene efficientemente riparato dal processo di riparo noto come Non-Homologous End Joining, il quale introduce inserzioni/delezioni casuali nel sito target. Invece, quando un Donor stampo portante regioni omologhe al sito tagliato è fornito assieme alle nucleasi, il DNA può essere riparato da un processo di Ricombinazione Omologa (Homologous Recombination, HR) che porta all’incorporazione della nuova sequenza nel sito target. In questo studio ho comparato diversi sistemi di delivery per TALEN e Donor stampo specificamente designati per mediare l’inserzione di un gene reporter GFP nel primo introne del gene PPP1C12A (il locus AAVS1) che è stato dimostrato essere un “sito sicuro” per l’espressione di transgeni. Per prima cosa, utilizzando una coppia di Zinc-Finger Nucleasi (ZFN) mirata al locus AAVS1 validata in precedenza, ho comparato 3 sistemi per il delivery della cassetta Donor esprimente GFP: trasfezione di DNA plasmidico circolare, infezione con vettori lentivirali e retrovirali integrasi-deficienti (IDLV e IDRV rispettivamente). I risultati ottenuti in merito all’efficienza di delivery e di HR hanno indicato IDLV come la piattaforma preferenziale per il delivery del Donor stampo. Successivamente ho testato 3 diversi sistemi di delivery per TALEN AAVS1-specifiche: infezione con vettori adenovirali, trasfezione di DNA plasmidico circolare e RNA messaggero. Ho qui comparato l’efficienza di delivery e di taglio e, infine, le frequenze di HR ottenute quando viene fornito un Donor stampo portante una cassetta di espressione del gene reporter GFP.
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Abstract
Genome editing mediated by Engineered EndoNucleases (EENs) allows the direct modification of a specific DNA sequence. Among EENs, Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) are characterized by an easy design, high sequence-specificity and reduced toxicity. EENs introduce a double-strand lesion in the desired target site which is subsequently mended by the cellular repair machinery. Usually the damage is efficiently repaired by the Non-Homologous End Joining repair mechanism, which introduces small random insertion/deletions in the target site. Instead, when a Donor template bearing regions homologous to the cleaved site is delivered along with EENs, DNA damage can be repaired via Homologous Recombination (HR), allowing the incorporation of a novel sequence in the target site. In this study, I compare different delivery systems for TALEN and Donor template specifically designed to mediate insertion of a GFP reporter gene into the first intron of the PPP1C12A gene (AAVS1 locus) demonstrated to be a “safe harbour” for transgene expression. First, using a previously validated ZFN pair targeting the AAVS1 locus, I compared 3 systems to deliver the donor GFP expression cassette: transfection of circularly closed plasmid DNA, infection by Integration-Defective Lentiviral or Retroviral vectors (IDLV and IDRV respectively). Results obtained measuring delivery efficiencies and HR frequencies indicated IDLV as the preferred platform to deliver the Donor template. Afterward, I tested 3 different delivery systems for AAVS1-specific TALENs: infection by adenoviral vector, transfection of circularly closed plasmid DNA and messanger RNA. Herein I compared the delivery and the cleavage efficiencies, and lastly the HR frequencies when a donor GFP cassette is provided by IDLV vector.
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