Riassunto analitico
Il cancro al seno (BC) è il cancro più frequentemente diagnosticato nelle donne e costituisce il 15% di tutte le morti per cancro femminile. Attualmente l’efficacia dei trattamenti è limitata dalla tossicità e resistenza ai farmaci e dalla mancanza di biomarcatori predittivi e prognostici affidabili. Recentemente, il crescente interesse per le vescicole extracellulari (EV) ha portato alla loro identificazione come importati attori nella comunicazione cellula-cellula nella tumorigenesi e progressione del cancro. Le EV sono piccole vescicole lipidiche racchiuse da un doppio strato in grado di trasportare DNA, mRNA, miRNA (miR), proteine transmembrana e non. In particolare, gli esosomi sono le vescicole più piccole (30-150nm) rilasciate da tutte le cellule vitali e sono abbondanti nei fluidi biologici. Sono anche secrete da cellule tumorali e in grado di trasferire il loro contenuto alle cellule vicine o lontane supportando la crescita del cancro e la metastatizzazione. Diversi studi hanno visto il ruolo dei miRNA esosomiali nella tumorigenesi, a causa del loro coinvolgimento nella differenziazione cellulare, sviluppo e apoptosi, perciò l’alterazione della loro espressione può causare la deregolazione dei geni target portando allo sviluppo di malattie come tumori. I miRNA esosomiali rilevati nel siero dei pazienti con BC sono stati considerati come potenziali biomarcatori per la diagnosi precoce. Partendo da queste osservazioni, nel nostro studio ci siamo concentrati su miR-21 e miR-105. Abbiamo prima valutato la migliore tecnica di isolamento per esosomi dal surnatante di due linee cellulari di BC note per esprimere alti livelli di miR-21 (linea MCF-7) o miR-105 (linea MDA-MB-231). La loro concentrazione è stata analizzata al Nanoparticle Tracking Analyzer ZetaView® e i livelli di miRNA valutati mediante Real Time PCR, confermando la maggiore espressione di miR-21 negli esosomi da MCF-7 e di miR-105 negli esosomi da MDA-MB-231. Abbiamo quindi proceduto con l'isolamento di esosomi di 10 donne donatrici sane come prova di principio. Abbiamo raccolto il siero da campioni di sangue, abbiamo isolato gli esosomi e analizzati allo ZetaView® per caratterizzarne dimensione e concentrazione. Abbiamo osservato una diminuzione delle dimensioni e un aumento del numero di esosomi con l'aumentare dell'età, tenendo conto anche dell'espressione di miR-21 e miR-105. miR-21 è stato rilevato in esosomi isolati da donatori sani, mentre abbiamo notato un'espressione molto bassa o nulla di miR-105. Questi risultati preliminari ci hanno permesso di standardizzare il metodo di isolamento e caratterizzazione della popolazione di esosomi dalla linea cellulare e da soggetti sani, suggerendone l'uso nel siero dei pazienti con BC.
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Abstract
Breast Cancer (BC) is the most frequently diagnosed cancer in women representing 15% of all female cancer deaths. Currently, the efficacy of the treatments for BC is still limited by drug toxicity and resistance and by the lack of reliable predictive and prognostic biomarkers. In recent years, the increasing interest in extracellular vesicles (EVs) has led to their identification as important actors in cell-to-cell communication involved in tumorigenesis and cancer progression. EVs are small lipid bilayer-enclosed vesicles capable of carrying DNA, mRNA, miRNA (miR), transmembrane and nonmembrane proteins. In particular, exosomes are the smallest vesicles (30-150nm) released by all viable cells and are abundant in all biological fluids. They are also secreted by cancer cells and are able to transfer their content to the closed cells or to distant sites supporting cancer growth and metastatisation. Several studies investigated the role of exosomal miRNAs in tumorigenesis, due to their involvement in cell differentiation, development and apoptosis, therefore, the alteration of their expression can cause deregulation of target genes, which can lead to the development of diseases like tumours. Interestingly, exosomal miRNAs were reported to be in serum of BC patients and they were considered potentially useful as biomarkers for early diagnosis.
Starting from these observations, in our study we focused on miRs involved in BC. Thus, we evaluated the most suitable exosome isolation technique from the supernatant of two BC cell lines known to express high level of exosomal miR-21 (MCF-7 cell line) or miR-105 (MDA-MB-231 cell line). The concentration and size of exosomes were analysed by the Nanoparticle Tracking Analyzer ZetaView® and the miRNA expression was evaluated by Real Time PCR, confirming the higher expression of miR-21 for exosomes isolated from MCF-7 and of miR-105 for exosomes from MDA-MB-231. We then proceeded with the isolation of exosomes 10 female healthy donors as a proof-of-principle. We collected serum from the whole blood samples, we isolated exosomes and analyzed them by the ZetaView® for characterizing their size and concentration. We observed a decrease in size and an increase in number of exosomes with increasing age, accounting also miR-21 and miR-105 expression. miR-21 was detected in exosomes isolated from healthy donors, while we noticed a very low or no expression of miR-105. These preliminary findings allowed us to standardize the method of isolation and characterization of exosomes population from cell line and healthy subjects prompting their uses in serum of BC patients.
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